【摘 要】
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以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏为基因克隆的材料,通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段(mLEAP2)进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及
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以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏为基因克隆的材料,通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段(mLEAP2)进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果,发现存在14个保守的氨基酸残基,其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域,在空间上可形成两对二硫键,推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2,使mLEAP2基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,在25℃下,经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后,成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,细胞经超声破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。
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