探讨受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶3(RIP3)在胆汁淤积性肝损伤中的作用及机制。
方法采用实验研究方法。(1)肝星状细胞株HSC-T6细胞处理和活性检测：采用RIP3-siRNA和NC-siRNA转染HSC-T6细胞。采用CCK8法检测未转染、转染RIP3-siRNA、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞存活率。采用100 μmol/L甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)试剂处理HSC-T6细胞后0、2、4、8、12 h取材细胞并保存，检测12 h细胞存活率。采用100 μmol/L GCDCA试剂处理RIP3敲低HSC-T6细胞后培养12 h，检测细胞存活率。(2)胆管结扎小鼠模型建立：采用随机数字表法将40只小鼠分为8组，每组5只。Sham组：仅游离胆总管，不结扎，于术后第7天取下腔静脉血和肝组织；BDL-1 d组、BDL-3 d组、BDL-5 d组、BDL-7 d组、BDL-14 d组、BDL-21 d组、BDL-28 d组：分别于行胆总管结扎术后第1、3、5、7、14、21、28天取材。(3)RT-PCR检测细胞和肝组织RIP3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TNF-α mRNA相对表达量。(4)Western blot检测细胞和肝组织RIP3、α-SMA、TNF-α蛋白相对表达量。正态分布的计量资料以
±s表示，不同时间点数据检验采用方差分析，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。
(1)不同HSC-T6细胞活性和RIP3、α-SMA、TNF-α mRNA及蛋白表达情况：CCK8检测结果显示：采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞后12 h细胞存活率分别为61.3%±0.3%和83.2%±0.4%，与未采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞培养12 h存活率(98.4%±0.7%和97.4%±0.7%)4者比较，差异有统计学意义(F＝115.200，P<0.05)。其中后两者比较，差异无统计学意义(t＝1.283，P>0.05)；未采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞存活率分别与采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞存活率比较，差异均有统计学意义(t＝17.910，6.604，P<0.05)；采用100 μmol/L GCDCA试剂处理HSC-T6细胞和RIP3敲低HSC-T6细胞存活率比较，差异有统计学意义(t＝7.186，P<0.05)。RT-PCR检测结果显示：未转染、转染RIP3-siRNA、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量分别为0.012 1±0.001 3、0.011 2±0.003 1、0.002 8±0.000 5，3者比较，差异有统计学意义(F＝20.410，P<0.05)。其中未转染的HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量与转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较，差异无统计学意义(t＝0.483，P>0.05)；转染RIP3-siRNA的HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量分别与未转染、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较，差异均有统计学意义(t＝11.760，4.586，P<0.05)。采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞后0、2、4、8、12 h RIP3 mRNA相对表达量分别为0.012 1±0.001 3、0.011 2±0.003 1、0.021 2±0.002 2、0.027 8±0.002 1、0.029 8±0.002 3，α-SMA mRNA相对表达量分别为0.571±0.012、0.611±0.024、0.691±0.021、0.711±0.021、0.752±0.031，TNF-α mRNA相对表达量分别为0.873±0.022、0.912±0.024、1.015±0.031、1.210±0.042、1.471±0.041，3者相对表达量均随时间延长升高，差异均有统计学意义(F＝70.720，30.050，166.700，P<0.05)。未采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞RIP3 mRNA相对表达量为0.012 1±0.001 3，采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞12 h后RIP3 mRNA相对表达量为0.029 8±0.002 3，两者比较，差异有统计学意义(t＝13.970，P<0.05)。Western blot检测结果显示：未转染、转染RIP3-siRNA、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量分别为0.054±0.012、0.013±0.008、0.052±0.021，3者比较，差异有统计学意义(F＝7.410，P<0.05)。其中未转染的HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量与转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较，差异无统计学意义(t＝0.143，P>0.05)；转染RIP3-siRNA的HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量分别与未转染、转染NC-siRNA的HSC-T6细胞比较，差异均有统计学意义(t＝4.924，3.006，P<0.05)。采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞后0、2、4、8、12 h RIP3蛋白相对表达量分别为0.045±0.024、0.047±0.034、0.062±0.025、0.121±0.015、0.154±0.034，α-SMA蛋白相对表达量分别为0.064±0.031、0.072±0.017、0.097±0.035、0.078±0.031、0.254±0.051，TNF-α蛋白相对表达量分别为0.078±0.025、0.094±0.037、0.129±0.041、0.198±0.011、0.324±0.061，3者相对表达量均随时间延长升高，差异均有统计学意义(F＝9.658，15.810，20.090，P<0.05)。未采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞RIP3蛋白相对表达量为0.045±0.024，采用GCDCA试剂处理HSC-T6细胞12 h后RIP3蛋白相对表达量为0.154±0.034，两者比较，差异有统计学意义(t＝4.536，P<0.05)。(2)各组小鼠肝组织中RIP3、α-SMA、TNF-α mRNA及蛋白表达情况：RT-PCR检测结果显示：Sham组、BDL-1 d组、BDL-3 d组、BDL-5 d组、BDL-7 d组、BDL-14 d组、BDL-21 d组、BDL-28 d组小鼠肝组织中RIP3 mRNA相对表达量为0.047 3±0.003 1、0.041 2±0.007 8～0.339 7±0.017 1，α-SMA mRNA相对表达量为2.948±0.612、2.654±1.032～8.387±0.910，TNF-α mRNA相对表达量为0.563±0.078、0.610±0.113～1.078±0.289，各组小鼠上述指标比较，差异均有统计学意义(F＝25.180，27.820，7.425，P<0.05)。Western blot检测结果显示：Sham组、BDL-1 d组、BDL-3 d组、BDL-5 d组、BDL-7 d组、BDL-14 d组、BDL-21 d组、BDL-28 d组小鼠肝组织中RIP3蛋白相对表达量为0.245±0.011、0.228±0.023～1.018±0.052，α-SMA蛋白相对表达量为0.424±0.057、0.392±0.041～0.985±0.081，TNF-α蛋白相对表达量为0.551±0.052、0.588±0.087～0.962±0.074，各组小鼠上述指标比较，差异均有统计学意义(F＝19.160，94.410，22.750，P<0.05)。
结论胆汁淤积通过诱导TNF-α通路活化，并上调RIP3，促进肝损伤和纤维化。