【摘 要】
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背景:phiC31是重要的基因治疗工具酶,其与细胞内蛋白的相互作用可能影响细胞内各种通路,从而关系到基因治疗的安全性.目的:构建锌指蛋白403基因原核表达载体,观察其在真核细
【机 构】
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复旦大学生命科学院遗传所,上海市,200433
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背景:phiC31是重要的基因治疗工具酶,其与细胞内蛋白的相互作用可能影响细胞内各种通路,从而关系到基因治疗的安全性.目的:构建锌指蛋白403基因原核表达载体,观察其在真核细胞的表达情况.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-10/2008-12在复旦大学遗传工程国家重点实验室完成.材料:大肠杆菌DH5a菌株及大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均为实验室保存.方法:用pLexA-phiC31作为"诱饵",对人胎脑cDNA文库通过酵母双杂交进行筛查,分离阳性克隆.对锌指蛋白403基因构建原核表达载体并纯化鉴定.脂质体介导真核细胞进行转染并细胞定位观察.主要观察指标:锌指蛋白403的原核表达载体的构建、纯化及在真核细胞细胞质中定位的结果.结果:酵母双杂交进行筛查后分离61个阳性克隆中,有1个包含17号染色体17q12上的基因序列,其具有一个锌指结构,故名锌指蛋白403.成功构建了锌指蛋白403的原核表达载体,并纯化组氨酸标记的锌指蛋白403.在真核细胞中,构建了绿荧光融合载体,证明了此蛋白在细胞质中的定位.结论:实验结果发现了一个新的phiC31整合酶相互作用蛋白,成功构建了znf403基因的原核表达载体,znf403蛋白主要在细胞质中聚集和分布.
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