【摘 要】
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目的 构建核苷酸结合寡聚结构域样受体家族成员X1(NLRX1)慢病毒质粒以及能够稳定过表达NLRX1的细胞系.方法 利用分子克隆方法从pCMV3-NLRX1质粒中克隆出NLRX1 cDNA全长片段,
【机 构】
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空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室,陕西西安,710032
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目的 构建核苷酸结合寡聚结构域样受体家族成员X1(NLRX1)慢病毒质粒以及能够稳定过表达NLRX1的细胞系.方法 利用分子克隆方法从pCMV3-NLRX1质粒中克隆出NLRX1 cDNA全长片段,将全长的NLRX1片段插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中得到过表达慢病毒质粒pCDH-NLRX1;将pCDH-NLRX1与包装质粒pMD2和pAX2共转染HEK293T细胞后包装、浓缩得到慢病毒颗粒并感染A549细胞,进而利用嘌呤霉素对感染后的A549细胞进行筛选得到稳定过表达NLRX1的A549细胞系.利用实时定量PCR检测感染A549细胞中NLRX1的mRNA水平,Western blot法检测其蛋白水平,免疫荧光细胞化学法检测NLRX1的表达.结果 成功构建pCDH-NLRX1质粒,pCDH-NLRX1与包装质粒共转染HEK293T细胞后,得到滴度约1×105转导单位(TU)/mL的慢病毒颗粒;包装成熟的pCDH-NLRX1慢病毒颗粒感染A549细胞后,利用嘌呤霉素对A549细胞进行筛选,得到NLRX1过表达稳转细胞系.感染的A549细胞中NLRX1表达明显,其mRNA水平和蛋白含量明显增加.结论 成功构建了过表达NLRX1的慢病毒质粒并建立了NLRX1过表达的稳定感染细胞系.
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