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【关键词】甜菊糖;高纯度;低温;分步结晶
【中图分类号】TS202.3 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）07-0049-03
0 引言
甜菊糖苷是从菊科草本植物甜叶菊中提取的极甜的非糖类物质，它的甜度可达蔗糖的250～450倍，而热量只有蔗糖的1/300且口感非常接近蔗糖，是经我国卫计委批准，继甘蔗、甜菜糖之外的第三种极具开发价值和保健功能的天然甜味剂，被国际上誉为“世界第三糖源”。目前，甜菊糖苷的纯化工艺主要采用重结晶法，需要使用大量有机溶剂（甲醇和乙醇），由于结晶母液中甜菊糖苷纯度低（10%～20%），现有技术无法得到高纯度甜菊糖苷（98%），导致大量高含量产品收率低，造成资源的大量浪费和环境的严重污染，所以不适合工业规模化生产[1]。本研究采用分布结晶技术，以含量为80%的甜菊糖苷为原料，制备含量不低于99%的高纯度甜菊糖苷产品，并获得最佳工艺参数，从而为高纯度甜菊糖苷产品产业化提供基础依据。
1 试验材料与仪器
1.1 材料
（1）原材料：甜菊糖苷（总苷80%，江西海富生物工程有限公司生产）。
（2）试剂：甜菊糖苷（≥99.0%）AR、无水乙醇AR、无水甲醇AR、氢氧化钠AR、磷酸AR、乙腈AR等。
1.2 主要仪器
高效液相色谱仪（型号为Waters 2695）、恒温水浴锅（上海仪电科学仪器股份有限公司）、分析天平（“日本岛津”生产）等。
2 方法
2.1 甜菊糖苷含量测定方法
甜菊糖苷含量的测定依照国家标准《GB 8270—2014》附录A.4中规定的方法进行测定。
2.2 工艺路线
（1）溶剂的配置：将一定量的有机醇溶剂与纯水按照一定的比例混合后，封闭待用。
（2）溶解：将100 g甜菊糖苷与溶剂按照一定的比例进行混合，然后将其加热至80 ℃进行回流搅拌，直至全部溶解。
（3）常温结晶：将溶解后的待结晶溶液置于常温条件下24 h后进行抽滤，并用95%的有机溶剂洗涤滤饼，收集滤饼并干燥称重得甜菊糖苷T1。
（4）低温结晶：将上述滤液置于低温条件下，静置24 h后，保持低温快速抽滤，并用低温的有机溶剂洗涤滤饼，收集滤饼并干燥称重得甜菊糖苷T2。
（5）冷冻结晶：将上述滤液置于冷冻温度条件下，静置24 h后，保持低温快速抽滤，并用冷冻温度的有机溶剂洗涤滤饼，收集滤饼并干燥称重得甜菊糖苷T3。
（6）母液回收：将上述得到的母液浓缩、干燥后称重，即得甜菊糖苷T4。
（7）合并：将上述得到的3个结晶甜菊糖苷产品（T1、T2、T3）合并、称重、检测，即得高含量甜菊糖苷。
工艺路线如图1所示。
2.3 数据统计与分析
数据统计采用Office 2020软件，数据分析处理采用SPSS 8.0软件。
2.4 低溫分步结晶工艺优化方法
在单因素试验的基础之，以乙醇浓度（A）、甜菊糖苷浓度（B）、常温（C）、低温（D）及冷冻（E）5个因素4个水平做多指标正交试验表L16（45）进行试验，对结晶制得甜菊糖苷重量及含量进行综合评分[2-3]。正交试验因素水平表见表1，多指标设计及结果见表2。
3 结果与分析
3.1 正交试验结果分析
对乙醇浓度（A）、甜菊糖苷浓度（B）、常温（C）、低温（D）及冷冻（E）5个单因素进行正交试验设计并针对所得甜菊糖苷重量和含量2个指标进行考察和分析，同时进行方差分析，从而确定高纯度甜菊糖苷分步结晶的最佳工艺参数和影响主次因素的顺序，其重量和含量结果见表2。
针对制得高纯度甜菊糖苷产品的重量情况来看，由表1可以看出，高纯度甜菊糖苷分步结晶的最佳工艺参数为A2B2C4D4E2或A3B2C4D4E2，即乙醇浓度（A）为80%或85%、浓度（B）为30%、常温（C）为30 ℃、低温（D）为5 ℃及冷冻（E）为-25 ℃。5个因素对高纯度甜菊糖苷分步结晶影响的主次因素为C>A>B>D>E。说明常温结晶温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶制得的产品质量影响最大，其次是乙醇浓度，再次是甜菊糖苷浓度，最后分别是低温结晶温度和冷冻结晶温度。
针对制得高纯度甜菊糖苷产品的含量来看，高纯度甜菊糖苷分步结晶的最佳工艺参数为A1B1C2D2E1，即乙醇浓度（A）为75%、浓度（B）为20%、常温（C）为20 ℃、低温（D）为-5 ℃及冷冻（E）为-30 ℃（见表1）。5个因素对高纯度甜菊糖苷分步结晶影响的主次因素顺序为B>C>D>E>A。说明甜菊糖苷浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶制得的产品质量影响最大，其次是常温结晶温度，再次是低温结晶温度，最后分别是冷冻结晶温度和乙醇浓度。 乙醇浓度对各指标的影响：从表3可以看出，乙醇浓度对含量的极差是最小的，也就是说，乙醇浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的含量影响最小。乙醇浓度对产品重量的影响较大且A2和A3等同，由于高浓度乙醇成本较高，所以综合考虑方案A2和A3，选择最佳方案为A2，即乙醇浓度为80%。
甜菊糖苷浓度对各指标的影响：从表3可以看出，甜菊糖苷浓度对含量的极差是最大，对产品重量影响适中，所以针对该研究是为了获得高纯度甜菊糖苷产品而言，优先考虑获得高纯度，即选对含量影响最大的因素，选择最佳方案为B1，即甜菊糖苷的浓度为20%。
常温结晶对各指标的影响：从表3可以看出，常温结晶对重量的极差都是最大，即影响最大，同时常温结晶对含量的影响也极大，也就是说，常温结晶对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品重量和含量的影响都最大或较大，所以针对该研究是为了获得高纯度甜菊糖苷产品而言，优先考虑获得高纯度，即选对含量影响最大的因素，选择最佳方案为C2，即常温结晶温度为20 ℃。
低温结晶各指标的影响：从表3可以看出，低温结晶对重量与含量的极差都是较小的，即影响较小，也就是说，低温结晶的温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品影响较小，综合考虑后，选择最佳方案为D3，即低温结晶温度为0 ℃。
冷冻结晶各指标的影响：从表3可以看出，冷冻结晶对重量与含量的极差是较小，即影响较小，也就是说，冷冻结晶的温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品影响较小，从节能的角度分析，综合考虑后，选择最佳方案为E2，即冷冻结晶温度为-25 ℃。
通过对各因素对两个指标影响的综合分析，得到理论上的最佳工艺参数为A2B1C2D3E2，即乙醇浓度为80%、甜菊糖苷浓度为20%。常温结晶温度为20 ℃、低温结晶温度为0 ℃、冷冻结晶温度为-25 ℃。
3.2 方差分析
为了判断以上5种受控因素对实验结果的影响情况，将多指标正交表进行方差分析，找出其影响质量和含量的主要来源。正交实验的方差分析结果见表4。
由表4的方差分析可以看出：C因素对产品重量的影响极其显著性，A因素对产品重量的影响显著，B因素对产品含量的影响显著，而D和E对含量和重量的影响都不显著。
综上所述，说明常温结晶温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的重量具有极其显著的影响，乙醇浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的重量具有显著的影响，甜菊糖苷浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的含量具有显著的影响，低温结晶温度和冷冻结晶温度对制得的产品重量与含量影响不显著。
3.3 验证试验
最佳工艺参数为A2B1C2D3E2，即乙醇浓度为80%、甜菊糖苷的浓度为20%、常温结晶温度为20 ℃、低温结晶温度为0 ℃、冷冻结晶温度为-25 ℃。重复试验，并进行质量和含量的测定，得到重量为70.3 g、含量为99.5%的高纯度甜菊糖苷產品，与理论值预期相符，高纯度甜菊糖苷收率达87.4%，符合产业化需求。
4 结论与建议
4.1 结论
（1）高纯度甜菊糖苷分布结晶的最佳工艺参数如下：乙醇的浓度为80%、甜菊糖苷的浓度为20%、常温结晶温度为20 ℃、低温结晶温度为0℃、冷冻结晶温度为-25 ℃。
（2）得到重量为70.3 g、含量为99.5%的高纯度甜菊糖苷产品，与理论值预期相符，高纯度甜菊糖苷收率达87.4%，符合产业化需求。
（3）常温结晶温度对高纯度甜菊糖苷重量具有显著的影响，乙醇浓度对高纯度甜菊糖苷重量具有显著的影响，甜菊糖苷浓度对高纯度甜菊糖苷含量具有显著的影响，低温结晶温度和冷冻结晶温度对制得的产品重量与含量影响不显著。
4.2 建议
（1）在本试验设计过程中，考虑使用乙醇作为有机溶剂，但未针对结晶所用的有机溶剂进行研究，例如甲醇、正丁醇或是各种有机醇的混合物，后续试验可以考虑将其他有机溶剂进行对比实验并进行优化，从而获得收率和含量更高且更易产业化的工艺。
（2）本试验中在分布结晶的过程中只考虑温度对结晶的影响，没有考虑每次分离之后所得母液有机溶剂浓度对结晶的影响，通过调整母液中有机溶剂的浓度，极有可能进一步提升含量和收率。
（3）本试验设计只针对质量和含量进行考察，未对甜菊糖苷产品的食品感官进行评定。甜菊糖苷为食品甜味剂，其口感滋味极为重要，口感不佳的产品很难有好的市场价值，后续试验应该进行重点考察纯化过程对口感滋味的影响。
（4）本试验考察的是甜菊糖苷总苷的含量，分布结晶对各种单独皂苷成分的影响情况没有考察，下一步试验可以针对此影响开展研究。
参 考 文 献
[1]额尔敦巴雅尔，云雪艳，王琦铭，等.甜菊糖结晶过程中化学成分的分布及其总糖含量变化研究[J].中国食品添加剂，2020，31（11）：10-19.
[2]何安乐，江玉姬，谢宝贵.灵芝多糖酶解-Sevage法联合脱蛋白工艺研究[J].中国食品工艺，2012（3）：54-58.
[3]刘庚贵，唐克军，罗习，等.利用“广西甜茶”生产≥98%甜茶苷的新工艺[J].企业科技与发展，2014（4）：11-12.
【中图分类号】TS202.3 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）07-0049-03
0 引言
甜菊糖苷是从菊科草本植物甜叶菊中提取的极甜的非糖类物质，它的甜度可达蔗糖的250～450倍，而热量只有蔗糖的1/300且口感非常接近蔗糖，是经我国卫计委批准，继甘蔗、甜菜糖之外的第三种极具开发价值和保健功能的天然甜味剂，被国际上誉为“世界第三糖源”。目前，甜菊糖苷的纯化工艺主要采用重结晶法，需要使用大量有机溶剂（甲醇和乙醇），由于结晶母液中甜菊糖苷纯度低（10%～20%），现有技术无法得到高纯度甜菊糖苷（98%），导致大量高含量产品收率低，造成资源的大量浪费和环境的严重污染，所以不适合工业规模化生产[1]。本研究采用分布结晶技术，以含量为80%的甜菊糖苷为原料，制备含量不低于99%的高纯度甜菊糖苷产品，并获得最佳工艺参数，从而为高纯度甜菊糖苷产品产业化提供基础依据。
1 试验材料与仪器
1.1 材料
（1）原材料：甜菊糖苷（总苷80%，江西海富生物工程有限公司生产）。
（2）试剂：甜菊糖苷（≥99.0%）AR、无水乙醇AR、无水甲醇AR、氢氧化钠AR、磷酸AR、乙腈AR等。
1.2 主要仪器
高效液相色谱仪（型号为Waters 2695）、恒温水浴锅（上海仪电科学仪器股份有限公司）、分析天平（“日本岛津”生产）等。
2 方法
2.1 甜菊糖苷含量测定方法
甜菊糖苷含量的测定依照国家标准《GB 8270—2014》附录A.4中规定的方法进行测定。
2.2 工艺路线
（1）溶剂的配置：将一定量的有机醇溶剂与纯水按照一定的比例混合后，封闭待用。
（2）溶解：将100 g甜菊糖苷与溶剂按照一定的比例进行混合，然后将其加热至80 ℃进行回流搅拌，直至全部溶解。
（3）常温结晶：将溶解后的待结晶溶液置于常温条件下24 h后进行抽滤，并用95%的有机溶剂洗涤滤饼，收集滤饼并干燥称重得甜菊糖苷T1。
（4）低温结晶：将上述滤液置于低温条件下，静置24 h后，保持低温快速抽滤，并用低温的有机溶剂洗涤滤饼，收集滤饼并干燥称重得甜菊糖苷T2。
（5）冷冻结晶：将上述滤液置于冷冻温度条件下，静置24 h后，保持低温快速抽滤，并用冷冻温度的有机溶剂洗涤滤饼，收集滤饼并干燥称重得甜菊糖苷T3。
（6）母液回收：将上述得到的母液浓缩、干燥后称重，即得甜菊糖苷T4。
（7）合并：将上述得到的3个结晶甜菊糖苷产品（T1、T2、T3）合并、称重、检测，即得高含量甜菊糖苷。
工艺路线如图1所示。
2.3 数据统计与分析
数据统计采用Office 2020软件，数据分析处理采用SPSS 8.0软件。
2.4 低溫分步结晶工艺优化方法
在单因素试验的基础之，以乙醇浓度（A）、甜菊糖苷浓度（B）、常温（C）、低温（D）及冷冻（E）5个因素4个水平做多指标正交试验表L16（45）进行试验，对结晶制得甜菊糖苷重量及含量进行综合评分[2-3]。正交试验因素水平表见表1，多指标设计及结果见表2。
3 结果与分析
3.1 正交试验结果分析
对乙醇浓度（A）、甜菊糖苷浓度（B）、常温（C）、低温（D）及冷冻（E）5个单因素进行正交试验设计并针对所得甜菊糖苷重量和含量2个指标进行考察和分析，同时进行方差分析，从而确定高纯度甜菊糖苷分步结晶的最佳工艺参数和影响主次因素的顺序，其重量和含量结果见表2。
针对制得高纯度甜菊糖苷产品的重量情况来看，由表1可以看出，高纯度甜菊糖苷分步结晶的最佳工艺参数为A2B2C4D4E2或A3B2C4D4E2，即乙醇浓度（A）为80%或85%、浓度（B）为30%、常温（C）为30 ℃、低温（D）为5 ℃及冷冻（E）为-25 ℃。5个因素对高纯度甜菊糖苷分步结晶影响的主次因素为C>A>B>D>E。说明常温结晶温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶制得的产品质量影响最大，其次是乙醇浓度，再次是甜菊糖苷浓度，最后分别是低温结晶温度和冷冻结晶温度。
针对制得高纯度甜菊糖苷产品的含量来看，高纯度甜菊糖苷分步结晶的最佳工艺参数为A1B1C2D2E1，即乙醇浓度（A）为75%、浓度（B）为20%、常温（C）为20 ℃、低温（D）为-5 ℃及冷冻（E）为-30 ℃（见表1）。5个因素对高纯度甜菊糖苷分步结晶影响的主次因素顺序为B>C>D>E>A。说明甜菊糖苷浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶制得的产品质量影响最大，其次是常温结晶温度，再次是低温结晶温度，最后分别是冷冻结晶温度和乙醇浓度。 乙醇浓度对各指标的影响：从表3可以看出，乙醇浓度对含量的极差是最小的，也就是说，乙醇浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的含量影响最小。乙醇浓度对产品重量的影响较大且A2和A3等同，由于高浓度乙醇成本较高，所以综合考虑方案A2和A3，选择最佳方案为A2，即乙醇浓度为80%。
甜菊糖苷浓度对各指标的影响：从表3可以看出，甜菊糖苷浓度对含量的极差是最大，对产品重量影响适中，所以针对该研究是为了获得高纯度甜菊糖苷产品而言，优先考虑获得高纯度，即选对含量影响最大的因素，选择最佳方案为B1，即甜菊糖苷的浓度为20%。
常温结晶对各指标的影响：从表3可以看出，常温结晶对重量的极差都是最大，即影响最大，同时常温结晶对含量的影响也极大，也就是说，常温结晶对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品重量和含量的影响都最大或较大，所以针对该研究是为了获得高纯度甜菊糖苷产品而言，优先考虑获得高纯度，即选对含量影响最大的因素，选择最佳方案为C2，即常温结晶温度为20 ℃。
低温结晶各指标的影响：从表3可以看出，低温结晶对重量与含量的极差都是较小的，即影响较小，也就是说，低温结晶的温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品影响较小，综合考虑后，选择最佳方案为D3，即低温结晶温度为0 ℃。
冷冻结晶各指标的影响：从表3可以看出，冷冻结晶对重量与含量的极差是较小，即影响较小，也就是说，冷冻结晶的温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品影响较小，从节能的角度分析，综合考虑后，选择最佳方案为E2，即冷冻结晶温度为-25 ℃。
通过对各因素对两个指标影响的综合分析，得到理论上的最佳工艺参数为A2B1C2D3E2，即乙醇浓度为80%、甜菊糖苷浓度为20%。常温结晶温度为20 ℃、低温结晶温度为0 ℃、冷冻结晶温度为-25 ℃。
3.2 方差分析
为了判断以上5种受控因素对实验结果的影响情况，将多指标正交表进行方差分析，找出其影响质量和含量的主要来源。正交实验的方差分析结果见表4。
由表4的方差分析可以看出：C因素对产品重量的影响极其显著性，A因素对产品重量的影响显著，B因素对产品含量的影响显著，而D和E对含量和重量的影响都不显著。
综上所述，说明常温结晶温度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的重量具有极其显著的影响，乙醇浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的重量具有显著的影响，甜菊糖苷浓度对高纯度甜菊糖苷分步结晶所得产品的含量具有显著的影响，低温结晶温度和冷冻结晶温度对制得的产品重量与含量影响不显著。
3.3 验证试验
最佳工艺参数为A2B1C2D3E2，即乙醇浓度为80%、甜菊糖苷的浓度为20%、常温结晶温度为20 ℃、低温结晶温度为0 ℃、冷冻结晶温度为-25 ℃。重复试验，并进行质量和含量的测定，得到重量为70.3 g、含量为99.5%的高纯度甜菊糖苷產品，与理论值预期相符，高纯度甜菊糖苷收率达87.4%，符合产业化需求。
4 结论与建议
4.1 结论
（1）高纯度甜菊糖苷分布结晶的最佳工艺参数如下：乙醇的浓度为80%、甜菊糖苷的浓度为20%、常温结晶温度为20 ℃、低温结晶温度为0℃、冷冻结晶温度为-25 ℃。
（2）得到重量为70.3 g、含量为99.5%的高纯度甜菊糖苷产品，与理论值预期相符，高纯度甜菊糖苷收率达87.4%，符合产业化需求。
（3）常温结晶温度对高纯度甜菊糖苷重量具有显著的影响，乙醇浓度对高纯度甜菊糖苷重量具有显著的影响，甜菊糖苷浓度对高纯度甜菊糖苷含量具有显著的影响，低温结晶温度和冷冻结晶温度对制得的产品重量与含量影响不显著。
4.2 建议
（1）在本试验设计过程中，考虑使用乙醇作为有机溶剂，但未针对结晶所用的有机溶剂进行研究，例如甲醇、正丁醇或是各种有机醇的混合物，后续试验可以考虑将其他有机溶剂进行对比实验并进行优化，从而获得收率和含量更高且更易产业化的工艺。
（2）本试验中在分布结晶的过程中只考虑温度对结晶的影响，没有考虑每次分离之后所得母液有机溶剂浓度对结晶的影响，通过调整母液中有机溶剂的浓度，极有可能进一步提升含量和收率。
（3）本试验设计只针对质量和含量进行考察，未对甜菊糖苷产品的食品感官进行评定。甜菊糖苷为食品甜味剂，其口感滋味极为重要，口感不佳的产品很难有好的市场价值，后续试验应该进行重点考察纯化过程对口感滋味的影响。
（4）本试验考察的是甜菊糖苷总苷的含量，分布结晶对各种单独皂苷成分的影响情况没有考察，下一步试验可以针对此影响开展研究。
参 考 文 献
[1]额尔敦巴雅尔，云雪艳，王琦铭，等.甜菊糖结晶过程中化学成分的分布及其总糖含量变化研究[J].中国食品添加剂，2020，31（11）：10-19.
[2]何安乐，江玉姬，谢宝贵.灵芝多糖酶解-Sevage法联合脱蛋白工艺研究[J].中国食品工艺，2012（3）：54-58.
[3]刘庚贵，唐克军，罗习，等.利用“广西甜茶”生产≥98%甜茶苷的新工艺[J].企业科技与发展，2014（4）：11-12.