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摘要 以一株实验室保存的米曲霉M1102为出发菌株，研究固态环境中碳源、氮源、初始pH值、含水量、培养温度、培养时间等因素对米曲霉产纤维素酶活力的影响。结果表明：当碳源为麸皮，氮源为豆饼粉，初始pH值为6.5，含水量为50%，培养温度为30 ℃，培养时间为60 h时，米曲霉产纤维素酶活力最高。
关键词 米曲霉；固态发酵；纤维素酶活
中图分类号 S147.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0197-02
Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.
Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity
我国农作物秸秆的利用率普遍很低，多数作物秸秆都作焚烧处理，对环境的污染很大。作物秸秆中含有丰富的有机质、氮、磷、钾等作物生长所需的营养元素，如果能得到合理的利用，将会为人类带来巨大的收益。作物秸秆的处理方式有物理、化学、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等优点[1]。作物秸秆中含有丰富的纤维素，纤维素在纤维素酶的作用下可以水解生成单糖被作物和微生物利用，但纤维素不易被降解，几十年来，人们对于纤维素的预处理及酶水解过程进行了大量研究，其中纤维素酶的使用大大提高了纤维素的降解率[2]。
米曲霉属半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纤维素酶的主要生产菌种之一。工业用米曲霉菌种所产的酶系较多、酶系组成较复杂[3]，国内对该菌株的相关研究并不多，对其酶系在工业发酵过程中受到的影响因素及其作用机理并不十分了解，从而导致在工业生产过程中不能够十分精确地控制米曲霉的产酶过程，限制了这一传统的食用菌株在工业应用领域的进一步拓展[4]。本试验对米曲霉M1102产纤维素酶在固体发酵过程中所受的影响及活性变化进行了研究，以期为米曲霉产纤维素酶的工业化生产提供相关的理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌种。米曲霉菌株M1102，来自中国菌种保藏中心。
1.1.2 培养基与主要试剂。斜面培养基：土豆培养基（PDA）；液体种子培养基：豆饼粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，调节pH值至7.0；营养盐溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，调节 pH值至7.0；固体培养基：木质纤维素培养基；主要试剂：麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素。
1.1.3 仪器设备。酒精灯、接种环、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、pH测定仪、紫外分光光度计、水浴锅、恒温培养箱、电子天平、控温摇床。
1.2 试验方法
1.2.1 培养方法。一是米曲霉种子液制备：将米曲霉接种于PDA斜面上进行活化，用接种环挑取一环接种于250 mL三角瓶的种子液中，装液量为50 mL，30 ℃，180 r/min，培养24 h。二是固体培养：在250 mL三角瓶中加入10 g风干后过筛的木质纤维原料和5 mL营养盐溶液，拌匀，121 ℃灭菌30 min，冷却后将种子液以3%的接种量接种于固体培养基中，32 ℃下培养60 h，测定其产纤维素酶活[5]。粗酶液的制备：每1g固态培养物加入磷酸缓冲溶液5.0 mL（pH值 7.2），室温下浸提1 h，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。
1.2.2 培养条件的优化。一是碳源对纤维素酶活的影响：分别用3%含量的麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作为培养基的碳源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定其纤维素酶含量[6]。二是氮源对纤维素酶活的影响：分别以2%的豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为培养基的氮源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定培养基中纤维素酶含量[6]。三是发酵条件优化：采用优化后的最佳发酵培养基，在固定其他发酵条件的基础上，逐一对发酵培养的初始pH值、培养基含水量、培养时间、发酵温度等培养条件进行优化。
1.2.3 纤维素酶活的测定方法。采用GB-羧甲基纤维素法（CMC法）。
2 结果与分析
2.1 培养基碳源对纤维素酶活力的影响
酶诱导物和酶蛋白质前体同时对纤维素酶的合成有调控作用，酶诱导物一般为可利用的碳源，纤维素作为酶诱导物对纤维素酶的产生有重要作用。从图1可以看出，在培养基其他基础营养成分不变的前提下，改变碳源含量后，米曲霉产纤维素酶活发生显著变化，其中碳源为麸皮时纤维素酶活最高；稻壳粉和玉米芯粉次之，为最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖为最高酶活的60%和37%；碳源为葡萄糖时纤维素酶活最低，仅为最高酶活的30%。当碳源中纤维素含量丰富时，米曲霉产纤维素酶活力高，这是由于纤维素作为酶诱导物能刺激纤维素酶的产生，将其分解为可利用的单糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源时，米曲霉能直接利用其作为碳源，所以抑制了纤维素酶的产生。 2.2 培养基氮源对纤维素酶活力影响
氮源是酶蛋白质前体的主要来源，因此氮源的类型和性质同样会影响纤维素酶的合成和分泌。选择不同氮源作为单一氮源进行发酵试验，来考察其对米曲霉产酶的影响。
从图2可以看出，在试验选用的5种有机和无机氮源中，以豆饼粉作为氮源时米曲霉所产纤维素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纤维素酶活是豆饼粉作为单一氮源时活性的96%和81%；当分别以硫酸铵和尿素为单一氮源时，米曲霉所产纤维素酶活性仅为最高酶活性的70%和68%。由此表明，有机氮源对纤维素酶活的影响大于无机氮源，这可能与有机氮源中营养成分含量多元化有关。
2.3 培养基初始pH值对纤维素酶活力的影响
微生物在生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，导致培养基pH值发生变化，而培养基初始pH值不仅影响微生物的生长繁殖，且对其产酶情况有显著的影响。在优化培养基碳氮源基础上，调节初始pH值为4.0～9.0来考察米曲霉产酶活性的变化。从图3 可以看出，米曲霉产生纤维素酶的最佳初始pH 值为6.0～7.5，当培养基初始pH值为5.5，米曲霉仍能产生相对于最高活性 72%的纤维素酶；而当培养基初始pH值调至8.0 时，米曲霉产生纤维素酶活性则迅速下降至最高酶活性的34%。试验表明米曲霉产纤维素酶的pH值适应范围较宽，但过酸或过碱的环境不利于纤维素酶的生产。这可能是由于过酸或过碱的环境不利于米曲霉生长或破坏了纤维素酶活力。
2.4 培养基含水量对纤维素酶活力的影响
水分是微生物生长代谢的重要物质，在固体发酵中，水分对微生物活性有重要影响。从图4可以看出，随着培养基中含水量的增加，米曲霉产纤维素酶活呈现先增高后降低的趋势，当培养基含水量为50%时，纤维素酶活最高。所以含水量过高或过低都会抑制米曲霉生长，这可能是由于低水分使米曲霉培养基中的营养物质溶解性降低，抑制了米曲霉生长；当水分含量过高时，培养基过于黏稠，破坏了培养基的多孔结构，降低了其透气性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧环境不利于其生长。
2.5 培养温度对纤维素酶活力的影响
微生物最适宜的温度范围一般为16～30 ℃，最高温度在37～43 ℃，温度过高或过低均不利于米曲霉生长。从图5可以看出，在30～35 ℃时，纤维素酶活最高，温度过低或过高都会降低纤维素酶活。这是由于，当温度过低时，米曲霉生
长缓慢导致产生纤维素酶少，而且低温环境会降低酶活力；当温度过高时，米曲霉会由于高温而出现老化现象，抑制了纤维素酶产生，并且高温容易使纤维素酶失活。
2.6 培养时间对纤维素酶活力的影响
微生物处于不同的生长期时，其相应的生长代谢机理也不同。从图6可以看出，随着培养时间的延长，米曲霉产纤维素酶活呈先升高后降低的趋势。当培养至60 h时，纤维素
酶活最高。这是由于培养初期米曲霉处于繁殖阶段，产生孢子数量有限，故分泌的纤维素酶少；而在培养后期，由于米曲霉出现老化，导致纤维素酶分泌量减少。
3 结论
本试验研究了米曲霉菌株M1102在不同固体发酵条件下产纤维素酶的变化。结果表明：当碳源为麸皮，氮源为豆饼粉，初始pH值为6.5，含水量为50%，培养温度为30 ℃，培养时间为60 h时，米曲霉产纤维素酶活力最高。为了深入了解米曲霉固体发酵产纤维素酶的影响因素，还需要对纤维素酶的生产条件和作用机理做更深一步的研究。
4 参考文献
[1] 袁喜庆.秸秆生物降解技术的效应[J].现代农业科技，2011（4）：261.
[2] 汤鸣强，郑 挺，曾小芳，等.酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究[J].中国调味品，2008（348）：38-40.
[3] 高晓梅，李杨，刘晓辉，等.固态发酵法生产大豆多肽的初步研究[J].山東农业科学，2014（7）：78-81.
[4] 孙春华，燕磊，常维山，等.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报，2007，20（5）：986-990.
[5] 李秀婷，赵进，鲁绯，等.米曲霉固态发酵产酶条件及酶活力的研究[J].中国酿造，2009（2）：26-28.
[6] 邓静，吴华昌，吴明霞，等.米曲霉产蛋白酶条件的优化[J].中国酿造，2008（12）：51-53.
关键词 米曲霉；固态发酵；纤维素酶活
中图分类号 S147.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0197-02
Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.
Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity
我国农作物秸秆的利用率普遍很低，多数作物秸秆都作焚烧处理，对环境的污染很大。作物秸秆中含有丰富的有机质、氮、磷、钾等作物生长所需的营养元素，如果能得到合理的利用，将会为人类带来巨大的收益。作物秸秆的处理方式有物理、化学、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等优点[1]。作物秸秆中含有丰富的纤维素，纤维素在纤维素酶的作用下可以水解生成单糖被作物和微生物利用，但纤维素不易被降解，几十年来，人们对于纤维素的预处理及酶水解过程进行了大量研究，其中纤维素酶的使用大大提高了纤维素的降解率[2]。
米曲霉属半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纤维素酶的主要生产菌种之一。工业用米曲霉菌种所产的酶系较多、酶系组成较复杂[3]，国内对该菌株的相关研究并不多，对其酶系在工业发酵过程中受到的影响因素及其作用机理并不十分了解，从而导致在工业生产过程中不能够十分精确地控制米曲霉的产酶过程，限制了这一传统的食用菌株在工业应用领域的进一步拓展[4]。本试验对米曲霉M1102产纤维素酶在固体发酵过程中所受的影响及活性变化进行了研究，以期为米曲霉产纤维素酶的工业化生产提供相关的理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌种。米曲霉菌株M1102，来自中国菌种保藏中心。
1.1.2 培养基与主要试剂。斜面培养基：土豆培养基（PDA）；液体种子培养基：豆饼粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，调节pH值至7.0；营养盐溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，调节 pH值至7.0；固体培养基：木质纤维素培养基；主要试剂：麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素。
1.1.3 仪器设备。酒精灯、接种环、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、pH测定仪、紫外分光光度计、水浴锅、恒温培养箱、电子天平、控温摇床。
1.2 试验方法
1.2.1 培养方法。一是米曲霉种子液制备：将米曲霉接种于PDA斜面上进行活化，用接种环挑取一环接种于250 mL三角瓶的种子液中，装液量为50 mL，30 ℃，180 r/min，培养24 h。二是固体培养：在250 mL三角瓶中加入10 g风干后过筛的木质纤维原料和5 mL营养盐溶液，拌匀，121 ℃灭菌30 min，冷却后将种子液以3%的接种量接种于固体培养基中，32 ℃下培养60 h，测定其产纤维素酶活[5]。粗酶液的制备：每1g固态培养物加入磷酸缓冲溶液5.0 mL（pH值 7.2），室温下浸提1 h，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。
1.2.2 培养条件的优化。一是碳源对纤维素酶活的影响：分别用3%含量的麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作为培养基的碳源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定其纤维素酶含量[6]。二是氮源对纤维素酶活的影响：分别以2%的豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为培养基的氮源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定培养基中纤维素酶含量[6]。三是发酵条件优化：采用优化后的最佳发酵培养基，在固定其他发酵条件的基础上，逐一对发酵培养的初始pH值、培养基含水量、培养时间、发酵温度等培养条件进行优化。
1.2.3 纤维素酶活的测定方法。采用GB-羧甲基纤维素法（CMC法）。
2 结果与分析
2.1 培养基碳源对纤维素酶活力的影响
酶诱导物和酶蛋白质前体同时对纤维素酶的合成有调控作用，酶诱导物一般为可利用的碳源，纤维素作为酶诱导物对纤维素酶的产生有重要作用。从图1可以看出，在培养基其他基础营养成分不变的前提下，改变碳源含量后，米曲霉产纤维素酶活发生显著变化，其中碳源为麸皮时纤维素酶活最高；稻壳粉和玉米芯粉次之，为最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖为最高酶活的60%和37%；碳源为葡萄糖时纤维素酶活最低，仅为最高酶活的30%。当碳源中纤维素含量丰富时，米曲霉产纤维素酶活力高，这是由于纤维素作为酶诱导物能刺激纤维素酶的产生，将其分解为可利用的单糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源时，米曲霉能直接利用其作为碳源，所以抑制了纤维素酶的产生。 2.2 培养基氮源对纤维素酶活力影响
氮源是酶蛋白质前体的主要来源，因此氮源的类型和性质同样会影响纤维素酶的合成和分泌。选择不同氮源作为单一氮源进行发酵试验，来考察其对米曲霉产酶的影响。
从图2可以看出，在试验选用的5种有机和无机氮源中，以豆饼粉作为氮源时米曲霉所产纤维素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纤维素酶活是豆饼粉作为单一氮源时活性的96%和81%；当分别以硫酸铵和尿素为单一氮源时，米曲霉所产纤维素酶活性仅为最高酶活性的70%和68%。由此表明，有机氮源对纤维素酶活的影响大于无机氮源，这可能与有机氮源中营养成分含量多元化有关。
2.3 培养基初始pH值对纤维素酶活力的影响
微生物在生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，导致培养基pH值发生变化，而培养基初始pH值不仅影响微生物的生长繁殖，且对其产酶情况有显著的影响。在优化培养基碳氮源基础上，调节初始pH值为4.0～9.0来考察米曲霉产酶活性的变化。从图3 可以看出，米曲霉产生纤维素酶的最佳初始pH 值为6.0～7.5，当培养基初始pH值为5.5，米曲霉仍能产生相对于最高活性 72%的纤维素酶；而当培养基初始pH值调至8.0 时，米曲霉产生纤维素酶活性则迅速下降至最高酶活性的34%。试验表明米曲霉产纤维素酶的pH值适应范围较宽，但过酸或过碱的环境不利于纤维素酶的生产。这可能是由于过酸或过碱的环境不利于米曲霉生长或破坏了纤维素酶活力。
2.4 培养基含水量对纤维素酶活力的影响
水分是微生物生长代谢的重要物质，在固体发酵中，水分对微生物活性有重要影响。从图4可以看出，随着培养基中含水量的增加，米曲霉产纤维素酶活呈现先增高后降低的趋势，当培养基含水量为50%时，纤维素酶活最高。所以含水量过高或过低都会抑制米曲霉生长，这可能是由于低水分使米曲霉培养基中的营养物质溶解性降低，抑制了米曲霉生长；当水分含量过高时，培养基过于黏稠，破坏了培养基的多孔结构，降低了其透气性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧环境不利于其生长。
2.5 培养温度对纤维素酶活力的影响
微生物最适宜的温度范围一般为16～30 ℃，最高温度在37～43 ℃，温度过高或过低均不利于米曲霉生长。从图5可以看出，在30～35 ℃时，纤维素酶活最高，温度过低或过高都会降低纤维素酶活。这是由于，当温度过低时，米曲霉生
长缓慢导致产生纤维素酶少，而且低温环境会降低酶活力；当温度过高时，米曲霉会由于高温而出现老化现象，抑制了纤维素酶产生，并且高温容易使纤维素酶失活。
2.6 培养时间对纤维素酶活力的影响
微生物处于不同的生长期时，其相应的生长代谢机理也不同。从图6可以看出，随着培养时间的延长，米曲霉产纤维素酶活呈先升高后降低的趋势。当培养至60 h时，纤维素
酶活最高。这是由于培养初期米曲霉处于繁殖阶段，产生孢子数量有限，故分泌的纤维素酶少；而在培养后期，由于米曲霉出现老化，导致纤维素酶分泌量减少。
3 结论
本试验研究了米曲霉菌株M1102在不同固体发酵条件下产纤维素酶的变化。结果表明：当碳源为麸皮，氮源为豆饼粉，初始pH值为6.5，含水量为50%，培养温度为30 ℃，培养时间为60 h时，米曲霉产纤维素酶活力最高。为了深入了解米曲霉固体发酵产纤维素酶的影响因素，还需要对纤维素酶的生产条件和作用机理做更深一步的研究。
4 参考文献
[1] 袁喜庆.秸秆生物降解技术的效应[J].现代农业科技，2011（4）：261.
[2] 汤鸣强，郑 挺，曾小芳，等.酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究[J].中国调味品，2008（348）：38-40.
[3] 高晓梅，李杨，刘晓辉，等.固态发酵法生产大豆多肽的初步研究[J].山東农业科学，2014（7）：78-81.
[4] 孙春华，燕磊，常维山，等.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报，2007，20（5）：986-990.
[5] 李秀婷，赵进，鲁绯，等.米曲霉固态发酵产酶条件及酶活力的研究[J].中国酿造，2009（2）：26-28.
[6] 邓静，吴华昌，吴明霞，等.米曲霉产蛋白酶条件的优化[J].中国酿造，2008（12）：51-53.