【摘 要】
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目的 研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响.方法 在成功构建人IRE1α基因全长重组质粒的基础上,
【机 构】
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重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室,重庆医科大学发育生物学与模式动物平台
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目的 研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响.方法 在成功构建人IRE1α基因全长重组质粒的基础上,设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体(pS1;pS2);采用巢式PCR扩增XBP1启动子,插入到pGL3-Basic载体,构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1.分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBP1报告基因重组质粒共转染入SW1353细胞和Saos-2细胞中,48 h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用.结果 酶切及测序结果证实siRNA1α干扰质粒和XBP1启动子真核表达载体均构建成功,双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中,直接载体pcDNA3.15(-)IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组(P＜0.5),并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和;而siIRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低.免疫印迹结果显示,过表达IRE1α明显上调剪接型XBP1S蛋白的表达.结论 人恶性骨肿瘤细胞中,过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达,并能有效促进XBP1U剪切生成XBP1S;通过siRNA方法抑制IRE1α后,XBP1启动子的转录与表达受到抑制.本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础,为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据.
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