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摘要 [目的]利用TaqMan特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中转基因成分。[方法]外源基因选取具有一定代表性的CaMV35S启动子、NOS终止子、BAR、CryIA（b）基因，数据结果由实时荧光定量PCR反应的Ct值判定。[结果]用该方法检测玉米籽粒中未含有转基因成分，可作为结果判定。[结论]该方法在样品量大时极具优势，高效，准确，对环境污染较小。
关键词 转基因玉米；实时荧光定量PCR；特异性；外源基因
中图分类号 S513文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-112-02
Abstract [Objective] To rapidly detect the transgenic ingredients in corn grain by TaqMan specificity fluorescent tags. [Method] CaMV35S promoters and NOS terminator， BAR， CryIA（b） gene with certain representativeness were selected as exogenous genes. Data results were judged by Ct value of real-time fluorescent quantitative PCR reaction. [Result] corn grain without transgenic ingredients detected by this method could be used as the judgement result. [Conclusion] This method is of most advantage under large sample amount. It is efficient and accurate， and has less pollution to the environment.
Key words Transgenic corn； Real-time fluorescent quantitative PCR； Specificity； Exogenous gene
随着转基因技术的飞速发展以及转基因生物的大面积推广，在关注转基因生物所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，转基因生物及其产品的安全性问题也引起了世界范围内的广泛关注。农业转基因生物及其产品对人类健康和生态环境是否会带来潜在不良影响，已引起人们的普遍关注。加强农业转基因生物及产品安全性监管，对保护和促进我国农产品贸易和我国农业生物技术产业的发展具有重要意义[1]。因此，转基因标识制度相继建立，对转基因检测技术也提出了严格的要求，转基因检测技术也成为研究热点。PCR检测具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，是目前检测转基因农作物和食品中转基因成分最为成熟和广泛应用的方法。
PCR仪检测方法有普通PCR荧光定性方法和实时荧光定量方法2种。前者提取待测样品DNA后经过PCR扩增、制胶、电泳，再由凝胶像仪观察电泳后胶板中DNA条带情况。此法可判断待测样品中是否含有转基因成分。影响结果正常表达的因素有很多： DNA浓度、电泳电压、跑胶时间、胶板厚度、气溶胶、人为判断误差等；后者提取待测样品DNA后无需经过电泳及凝胶成像步骤，直接扩增，由PCR仪荧光检测器捕获信号。常用2种荧光标记方法：SYBR Green非特异性荧光标记法和TaqMan特异性荧光标记法[2]。SYBR Green非特异性荧光标记法虽然操作方便，但反应时易产生假阳性，影响结果判断。笔者利用TaqMan特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中是否存在转基因成分。
1 材料与方法
1.1 试验材料 选取玉米籽粒阴性对照样品一份，转基因玉米Bt11阳性样品一份，待测玉米籽粒样品一份。
1.2 试剂及仪器
植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技公司；Premix EX Taq，大连宝生物工程有限公司；iTaq Universal Probes Supermix，BIO-RAD公司；引物及探针，Invitrogen沈阳汇佰生物科技公司合成；BIO-RAD IQ5定量PCR仪，美国伯乐公司；NanoDrop2000型DNA定量仪，美国Thermostat公司；台式离心机，德国Eppendorf公司；生物安全柜，苏州净化设备有限公司[3]。
1.3 试验方法
1.3.1 DNA提取。将待测玉米籽粒在无菌条件下研磨，充分混匀样品，按四分法各取样品0.1～0.2 mg，分装至3个离心管中，采用试剂盒提取DNA，制备成待测样品DNA溶液。将玉米阴性样品、玉米阳性样品及待测样品检测浓度后待用[4-5]。
1.3.2 扩增体系制备[2]。扩增体系见表1。
对玉米样品中转基因成分的检测，参数可选择CaMV35S启动子、NOS终止子、BAR、CryIA（b）基因。结果为阳性时进一步对转基因品系进行鉴定。
1.3.3 实时荧光PCR反应参数。
实时荧光定量PCR反应程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，40个循环[6]。实时荧光定量PCR扩增所用引物和探针见表2。
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量
DNA溶液经DNA定量仪测定，提取的DNA完整性很好，OD260/OD280均在1.8～1.9，符合定量PCR检测要求。
2.2 实时荥光定量PCR结果
待测样品、玉米阴性对照样品和玉米阳性对照样品每个参数共2个平行反应，同时做空白对照，即03～04空白对照，05～06阴性对照，07～08待检样品，09～10阳性对照。共选取内标基因及外源基因5组参数：B行筛选CaMV35S基因，C行筛选NOS基因，D行筛选BAR基因，E行筛选CryIA（b）基因，F行内标基因。由每组参数Ct值可以判定，该试验结果有效：外源基因组Ct值大于或等于40，内源基因检测Ct值小于或等于24，判定此样本未检出该外源基因。外源基因组Ct值小于或等于36，内源基因检测Ct值小于或等于24，判定此样本检出该外源基因。
由表3可知，阴性对照样品、阳性对照样品及待测样品内标基因Ct值均小于等于24，为玉米样品；待测样品检测其余筛选的外源基因均未检测到。由此可知，该玉米籽粒中未含有转基因成分，可作为结果判定。
3 讨论
该研究利用TaqMan特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中转基因成分，可达到快速、准确检测大量样品的目的，无需配制标准曲线，可做定性分析。目前实时荧光定量PCR均采用外标定量，需要已知浓度的检测物作为参照样品，参照标准品的制备费时、费力、成本高。当无需被测样品转基因成分含量只需定性分析时，用普通PCR仪后期工作量大，
在环境中易形成气溶胶，造成二次污染，影响结果正常分析。实时荧光PCR反应可避免对环境及人体造成危害，环保高
效，为人所用。
参考文献
[1]郭金超，付仲文，于晴，等.对我国农业转基因作物研发及安全管理的思考[J].安徽农业科学，2015（25）：333-336.
[2] 宋君，雷绍荣，刘勇，等.转基因玉米MON863 品系特异定量PCR 方法的建立[J].湖北农业科学，2011， 50（24）： 5250-5253.
[3] 袁磊，红炜，李凡.以实时荧光定量PCR 技术检测转基因玉米MON88017[J].作物学报，2011， 37（11）： 2117-2121.
[4] 中华人民共和国上海出入境检验检疫总局.转基因产品检测 核酸定性PCR 检测方法：GB/T19495.4—2004[S].北京：中国标准出版社，2004.
[5] 中华人民共和国山东出入境检验检疫总局.转基因产品检测核酸定量PCR 检测方法：GB/T19495.5—2004[S].北京：中国标准出版社，2004.
[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因成分检测 玉米检测方法：SN/T 1196-2012[S].北京：中国标准出版社，2013.
关键词 转基因玉米；实时荧光定量PCR；特异性；外源基因
中图分类号 S513文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-112-02
Abstract [Objective] To rapidly detect the transgenic ingredients in corn grain by TaqMan specificity fluorescent tags. [Method] CaMV35S promoters and NOS terminator， BAR， CryIA（b） gene with certain representativeness were selected as exogenous genes. Data results were judged by Ct value of real-time fluorescent quantitative PCR reaction. [Result] corn grain without transgenic ingredients detected by this method could be used as the judgement result. [Conclusion] This method is of most advantage under large sample amount. It is efficient and accurate， and has less pollution to the environment.
Key words Transgenic corn； Real-time fluorescent quantitative PCR； Specificity； Exogenous gene
随着转基因技术的飞速发展以及转基因生物的大面积推广，在关注转基因生物所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，转基因生物及其产品的安全性问题也引起了世界范围内的广泛关注。农业转基因生物及其产品对人类健康和生态环境是否会带来潜在不良影响，已引起人们的普遍关注。加强农业转基因生物及产品安全性监管，对保护和促进我国农产品贸易和我国农业生物技术产业的发展具有重要意义[1]。因此，转基因标识制度相继建立，对转基因检测技术也提出了严格的要求，转基因检测技术也成为研究热点。PCR检测具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，是目前检测转基因农作物和食品中转基因成分最为成熟和广泛应用的方法。
PCR仪检测方法有普通PCR荧光定性方法和实时荧光定量方法2种。前者提取待测样品DNA后经过PCR扩增、制胶、电泳，再由凝胶像仪观察电泳后胶板中DNA条带情况。此法可判断待测样品中是否含有转基因成分。影响结果正常表达的因素有很多： DNA浓度、电泳电压、跑胶时间、胶板厚度、气溶胶、人为判断误差等；后者提取待测样品DNA后无需经过电泳及凝胶成像步骤，直接扩增，由PCR仪荧光检测器捕获信号。常用2种荧光标记方法：SYBR Green非特异性荧光标记法和TaqMan特异性荧光标记法[2]。SYBR Green非特异性荧光标记法虽然操作方便，但反应时易产生假阳性，影响结果判断。笔者利用TaqMan特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中是否存在转基因成分。
1 材料与方法
1.1 试验材料 选取玉米籽粒阴性对照样品一份，转基因玉米Bt11阳性样品一份，待测玉米籽粒样品一份。
1.2 试剂及仪器
植物基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技公司；Premix EX Taq，大连宝生物工程有限公司；iTaq Universal Probes Supermix，BIO-RAD公司；引物及探针，Invitrogen沈阳汇佰生物科技公司合成；BIO-RAD IQ5定量PCR仪，美国伯乐公司；NanoDrop2000型DNA定量仪，美国Thermostat公司；台式离心机，德国Eppendorf公司；生物安全柜，苏州净化设备有限公司[3]。
1.3 试验方法
1.3.1 DNA提取。将待测玉米籽粒在无菌条件下研磨，充分混匀样品，按四分法各取样品0.1～0.2 mg，分装至3个离心管中，采用试剂盒提取DNA，制备成待测样品DNA溶液。将玉米阴性样品、玉米阳性样品及待测样品检测浓度后待用[4-5]。
1.3.2 扩增体系制备[2]。扩增体系见表1。
对玉米样品中转基因成分的检测，参数可选择CaMV35S启动子、NOS终止子、BAR、CryIA（b）基因。结果为阳性时进一步对转基因品系进行鉴定。
1.3.3 实时荧光PCR反应参数。
实时荧光定量PCR反应程序：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，40个循环[6]。实时荧光定量PCR扩增所用引物和探针见表2。
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量
DNA溶液经DNA定量仪测定，提取的DNA完整性很好，OD260/OD280均在1.8～1.9，符合定量PCR检测要求。
2.2 实时荥光定量PCR结果
待测样品、玉米阴性对照样品和玉米阳性对照样品每个参数共2个平行反应，同时做空白对照，即03～04空白对照，05～06阴性对照，07～08待检样品，09～10阳性对照。共选取内标基因及外源基因5组参数：B行筛选CaMV35S基因，C行筛选NOS基因，D行筛选BAR基因，E行筛选CryIA（b）基因，F行内标基因。由每组参数Ct值可以判定，该试验结果有效：外源基因组Ct值大于或等于40，内源基因检测Ct值小于或等于24，判定此样本未检出该外源基因。外源基因组Ct值小于或等于36，内源基因检测Ct值小于或等于24，判定此样本检出该外源基因。
由表3可知，阴性对照样品、阳性对照样品及待测样品内标基因Ct值均小于等于24，为玉米样品；待测样品检测其余筛选的外源基因均未检测到。由此可知，该玉米籽粒中未含有转基因成分，可作为结果判定。
3 讨论
该研究利用TaqMan特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中转基因成分，可达到快速、准确检测大量样品的目的，无需配制标准曲线，可做定性分析。目前实时荧光定量PCR均采用外标定量，需要已知浓度的检测物作为参照样品，参照标准品的制备费时、费力、成本高。当无需被测样品转基因成分含量只需定性分析时，用普通PCR仪后期工作量大，
在环境中易形成气溶胶，造成二次污染，影响结果正常分析。实时荧光PCR反应可避免对环境及人体造成危害，环保高
效，为人所用。
参考文献
[1]郭金超，付仲文，于晴，等.对我国农业转基因作物研发及安全管理的思考[J].安徽农业科学，2015（25）：333-336.
[2] 宋君，雷绍荣，刘勇，等.转基因玉米MON863 品系特异定量PCR 方法的建立[J].湖北农业科学，2011， 50（24）： 5250-5253.
[3] 袁磊，红炜，李凡.以实时荧光定量PCR 技术检测转基因玉米MON88017[J].作物学报，2011， 37（11）： 2117-2121.
[4] 中华人民共和国上海出入境检验检疫总局.转基因产品检测 核酸定性PCR 检测方法：GB/T19495.4—2004[S].北京：中国标准出版社，2004.
[5] 中华人民共和国山东出入境检验检疫总局.转基因产品检测核酸定量PCR 检测方法：GB/T19495.5—2004[S].北京：中国标准出版社，2004.
[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因成分检测 玉米检测方法：SN/T 1196-2012[S].北京：中国标准出版社，2013.