【摘 要】
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个
【基金项目】
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国家转基因生物新品种培育重大专项;
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义.本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen 1-opLA,将其转染至猪(Sus scrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞.根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-ZsGreen1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体；脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞；RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-ZsGreen1 -opLA构建成功；荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-ZsGreen1 -opLA和pIRES2-ZsGreen1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核；筛选重组细胞的最小G418浓度为400 ng/μL; RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到.本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen 1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞.
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