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【摘要】目的：研究利用人骨髓间充质干细胞(MSC)治疗再生障碍性贫血(AA)的机制。方法：对人骨髓间充质干细胞进行分离培养得到T淋巴细胞。然后用植物血凝素(PHA)刺激AA患者的T淋巴细胞增殖体系，加入不同剂量的MSC，通过流式细胞术计算CD+3T细胞CD2(IL-2R)的表达率，以确定MSC对AA患者T细胞的影响作用。结果：AA患者T淋巴细胞增殖及CD25明显受到MSC指定剂量的抑制作用。
【关键词】充质干细胞；再生障碍性贫血；T淋巴细胞
1引言
人骨髓间充质干细胞（MSC）是一种骨髓的间充质非造血干细胞，它可以分化成内皮、肌肉、软骨、成骨等多种细胞，但它没有发育成单体的功能。据有关资料显示，MSC具有多向分化和自我更新的潜能，对造血干细胞的增殖、分化起着关键作用，在衰老、疾病、损伤等病理环境中有较强的组织修复和调节功能。再生障碍性贫血（AA）是一种免疫异常的血液疾病，它的临床表现为三系血细胞减少，非造血干细胞增多。随着医学理论研究的进一步发展，认为该病与细胞免疫异常有关。研究认为TNF-α、IL-2、IFN-γ是AA患者细胞表达增高的主要因子，随着相关因子的增加，血清和骨髓液中的肿瘤坏死因子就会不断升高，靶细胞上的受体增加和负调控因子量的增加共同作用而致病。有大量文献指出，骨髓间充质干细胞（MSC）具有免疫调节作用，可治疗自身免疫性疾病。本研究也旨在探讨MSC治疗再生障碍性贫血(AA)机制[1]，现报道如下。
2资料与方法
病例资料：2010年4月-2011年5月，我院血液科共收治AA患者56例。其中重型（SAA）患者38例（68%），女14例，男24例，中位年龄43岁；慢性（CAA）患者18例（32%），男12例，女6例，中位年龄39岁。经诊断全部符合《血液病诊断及疗效标准》，且骨髓单个核细胞Coombs试验阴性。
MSC的分离、培养及表面分子鉴定：用PBS倍比稀释添加抗凝素的成人骨髓，高速离心（1500r/min）30分钟，收取单个核细胞，然后用PBS洗涤3~4次，在37℃、5%CO2的饱合湿度环境下，以2×105/cm2密度接种在含有10%FBS低糖DMEM的培养瓶中。培养过程中应观察细胞的贴壁情况，在72小时后可去除非贴壁细胞，3d换一次营养液。待细胞贴壁率达90%以上时，可使0.125%胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，再用流式细胞仪确定MSC的分离纯度[2]。
外周血T淋巴细胞的分离培养：取AA患者外周血，肝素抗凝，然后用PBS倍比稀释，使用RPMI1640培养基培养，培养基内添加20%的PBS，细胞浓度约为4×107·mL-1，取尼龙棉柱，将培养液缓慢注入，在37℃的恒温温箱内孵育1h，再除去非黏附细胞，即可得到T淋巴细胞。
T淋巴细胞增殖的检测：将用胰酶消化后的MSC分成三组，A组浓度为2×105·mL-1，B组浓度为1×105·mL-1，C组浓度为1×104·mL-1。使用96孔板，每孔加入量为100μL，观察得MSC贴壁后，用剂量为10Gy的60Co-γ射线进行照射，其目的是为了去除MSC的分化增殖能力。将浓度为1×106·mL-1AA患者的T淋巴细胞接种于A、B、C三组上，并以60Co-γ射线照射过的单纯性AA患者的T淋巴细胞为参照组。使用一定量的植物血凝素（10μg·mL-1），在37℃、5%CO2的温箱内刺激T淋巴细胞增殖，时间为72小时，之后每孔加入20μL的MTT，使用酶标仪没出OD值。
T淋巴细胞CD25检测：每组加入抗-CD3-FITC和抗-CD25-PE，做荧光素标记，先在无光室温条件下孵育半小时，再加入PBD洗涤，加入10g/L的多聚甲醛0.4ml，降温至4℃固定半小时，再用流式细胞仪分析CD+3、CD+25T细胞的百分率。
3结果
MSC的纯度鉴定：3代以后MSC的纯度可达95%以上。MSC抑制AA患者T淋巴细胞的增殖：MSC的抵制效果很明显，而且数量越多效果越好。通过A、B、C三组试验可知，A、B两组抑制效果明显，有统计学意义，而C组虽然有差异，但效果不明显。MSC抑制T淋巴细胞CD25的表达：A、B两组中，MSCT淋巴细胞CD25的表达有明显的抑制效果，而C组则没有，无统计学意义。
4讨论
众多文献资料表明，再生障碍性贫血（AA）的发病机制与T淋巴细胞及其分泌的造血负调控因子有关，当AA的CD+8T被异常活化和增殖，就会导致造血衰竭。而近年来又有诸多研究表明，MSC可以起到抑制T细胞增殖的免疫调控作用，并且抵制效果与它的剂量有关。其机理是IL-2是T细胞增殖最重要因素，而MSC可下调IL-2R的表达，起到控制IL-2产生的作用[3]。目前，骨髓移植是治疗AA的首选措施，但是有效率低、副作用大，不是十分理想的选择。通过相关文献资料以及本课题的实验结果发现，MSC可抵制T细胞的活化与增殖，在理论上治疗AA是可行的。本实验也仅限于体外，MSC在人体上治疗AA还待进一步的深入研究。
参考文献
[1]Gronthos S，Zannettino AC，Hay SJ，etal. Marrow Mesenchymal Stem Cells and applications. Journal of Pediatrics, 2003 (05).
[2]程家凤,王晓培,刘燕,等.骨髓间充质干细胞与再生障碍性贫血[J].中华全科医学, 2008,6(8).
[3]高肠，肖扬，庞妍，等.再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞体外生物学特性与其免疫调节缺陷[J].1陆床血液学杂志，2009，22(5).
【关键词】充质干细胞；再生障碍性贫血；T淋巴细胞
1引言
人骨髓间充质干细胞（MSC）是一种骨髓的间充质非造血干细胞，它可以分化成内皮、肌肉、软骨、成骨等多种细胞，但它没有发育成单体的功能。据有关资料显示，MSC具有多向分化和自我更新的潜能，对造血干细胞的增殖、分化起着关键作用，在衰老、疾病、损伤等病理环境中有较强的组织修复和调节功能。再生障碍性贫血（AA）是一种免疫异常的血液疾病，它的临床表现为三系血细胞减少，非造血干细胞增多。随着医学理论研究的进一步发展，认为该病与细胞免疫异常有关。研究认为TNF-α、IL-2、IFN-γ是AA患者细胞表达增高的主要因子，随着相关因子的增加，血清和骨髓液中的肿瘤坏死因子就会不断升高，靶细胞上的受体增加和负调控因子量的增加共同作用而致病。有大量文献指出，骨髓间充质干细胞（MSC）具有免疫调节作用，可治疗自身免疫性疾病。本研究也旨在探讨MSC治疗再生障碍性贫血(AA)机制[1]，现报道如下。
2资料与方法
病例资料：2010年4月-2011年5月，我院血液科共收治AA患者56例。其中重型（SAA）患者38例（68%），女14例，男24例，中位年龄43岁；慢性（CAA）患者18例（32%），男12例，女6例，中位年龄39岁。经诊断全部符合《血液病诊断及疗效标准》，且骨髓单个核细胞Coombs试验阴性。
MSC的分离、培养及表面分子鉴定：用PBS倍比稀释添加抗凝素的成人骨髓，高速离心（1500r/min）30分钟，收取单个核细胞，然后用PBS洗涤3~4次，在37℃、5%CO2的饱合湿度环境下，以2×105/cm2密度接种在含有10%FBS低糖DMEM的培养瓶中。培养过程中应观察细胞的贴壁情况，在72小时后可去除非贴壁细胞，3d换一次营养液。待细胞贴壁率达90%以上时，可使0.125%胰蛋白酶-EDTA进行消化处理，再用流式细胞仪确定MSC的分离纯度[2]。
外周血T淋巴细胞的分离培养：取AA患者外周血，肝素抗凝，然后用PBS倍比稀释，使用RPMI1640培养基培养，培养基内添加20%的PBS，细胞浓度约为4×107·mL-1，取尼龙棉柱，将培养液缓慢注入，在37℃的恒温温箱内孵育1h，再除去非黏附细胞，即可得到T淋巴细胞。
T淋巴细胞增殖的检测：将用胰酶消化后的MSC分成三组，A组浓度为2×105·mL-1，B组浓度为1×105·mL-1，C组浓度为1×104·mL-1。使用96孔板，每孔加入量为100μL，观察得MSC贴壁后，用剂量为10Gy的60Co-γ射线进行照射，其目的是为了去除MSC的分化增殖能力。将浓度为1×106·mL-1AA患者的T淋巴细胞接种于A、B、C三组上，并以60Co-γ射线照射过的单纯性AA患者的T淋巴细胞为参照组。使用一定量的植物血凝素（10μg·mL-1），在37℃、5%CO2的温箱内刺激T淋巴细胞增殖，时间为72小时，之后每孔加入20μL的MTT，使用酶标仪没出OD值。
T淋巴细胞CD25检测：每组加入抗-CD3-FITC和抗-CD25-PE，做荧光素标记，先在无光室温条件下孵育半小时，再加入PBD洗涤，加入10g/L的多聚甲醛0.4ml，降温至4℃固定半小时，再用流式细胞仪分析CD+3、CD+25T细胞的百分率。
3结果
MSC的纯度鉴定：3代以后MSC的纯度可达95%以上。MSC抑制AA患者T淋巴细胞的增殖：MSC的抵制效果很明显，而且数量越多效果越好。通过A、B、C三组试验可知，A、B两组抑制效果明显，有统计学意义，而C组虽然有差异，但效果不明显。MSC抑制T淋巴细胞CD25的表达：A、B两组中，MSCT淋巴细胞CD25的表达有明显的抑制效果，而C组则没有，无统计学意义。
4讨论
众多文献资料表明，再生障碍性贫血（AA）的发病机制与T淋巴细胞及其分泌的造血负调控因子有关，当AA的CD+8T被异常活化和增殖，就会导致造血衰竭。而近年来又有诸多研究表明，MSC可以起到抑制T细胞增殖的免疫调控作用，并且抵制效果与它的剂量有关。其机理是IL-2是T细胞增殖最重要因素，而MSC可下调IL-2R的表达，起到控制IL-2产生的作用[3]。目前，骨髓移植是治疗AA的首选措施，但是有效率低、副作用大，不是十分理想的选择。通过相关文献资料以及本课题的实验结果发现，MSC可抵制T细胞的活化与增殖，在理论上治疗AA是可行的。本实验也仅限于体外，MSC在人体上治疗AA还待进一步的深入研究。
参考文献
[1]Gronthos S，Zannettino AC，Hay SJ，etal. Marrow Mesenchymal Stem Cells and applications. Journal of Pediatrics, 2003 (05).
[2]程家凤,王晓培,刘燕,等.骨髓间充质干细胞与再生障碍性贫血[J].中华全科医学, 2008,6(8).
[3]高肠，肖扬，庞妍，等.再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞体外生物学特性与其免疫调节缺陷[J].1陆床血液学杂志，2009，22(5).