【摘 要】
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为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用,构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs(rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列,设计并合成包含
【机 构】
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福建医科大学附属第一医院神经内科; 福建省神经病学研究所; 福建医科大学神经生物学中心; 福建师范大学生命科学学院;
【基金项目】
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卫生部科学研究基金-福建省卫生教育联合攻关计划资助项目(No.WKJ2005-2-011)资助~~
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为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用,构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs(rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列,设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面,产生pRiCXCR4,将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP,产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后,用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示,酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确,产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP,未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后,与空载体组和空白组相比,3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达,CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%,抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功,为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。
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