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目的
探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率。
方法针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA(siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定。将测序正确的Gab1-RNAi、p Helper 1. 0和p Helper 2. 0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度。将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率。
结果经PCR分析和测序证实,成功构建LVGab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70%以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0. 088±0. 003)较对照(0. 947±0. 087)组和空白组(0. 999±0. 067)显著降低(P< 0. 01)。
结论成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA. hy926细胞株中的表达。