【摘 要】
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目的 比较四种方法所提取的人脐带间充质干细胞细胞外囊泡(EV)的效率.方法 收集人脐带间充质干细胞的培养基上清液,通过差速离心法(方法A)、超滤结合差速离心法(方法B)、超滤
【机 构】
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武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系,湖北武汉430072;华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心;武汉汉密顿生物科技股份有限公司研发中心,湖北武汉430075;华中科技大学同济医学院附属同济
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目的 比较四种方法所提取的人脐带间充质干细胞细胞外囊泡(EV)的效率.方法 收集人脐带间充质干细胞的培养基上清液,通过差速离心法(方法A)、超滤结合差速离心法(方法B)、超滤结合聚乙二醇沉淀法(方法C)、超滤结合水两相系统法(方法D)提取EV.利用二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒检测各组EV的总蛋白浓度,Western blot法检测EV表面标志物凋亡关联基因2相互作用蛋白X(Alix)、CD9与阴性对照钙连蛋白(calnexin),透射电镜检测EV的形态,纳米颗粒跟踪分析检测EV的粒径分布与颗粒数.结果 以上四种方法提取的EV蛋白含量分别为(1.92±1.77)μg/μL、(18.10 ±1.07)μg/μL、(6.33 ±1.02)μg/μL、(36.48 ±23.13)μg/μL.A、B、C 三种方法所分离的EV 的CD9、Alix 均呈阳性,其中方法C的表达量最低;阴性蛋白calnexin均呈阴性.方法D所得EV检测CD9、Alix、calnexin均呈现阴性.A、B、C三种方法提取的EV颗粒数分别为0.85 × 1011/mL、0.63 × 1011/mL、1.83 × 1011/mL,且粒径分布均符合细胞外囊泡的粒径范围.透射电镜检测A、B、C三种方法所提EV均有典型的杯托状膜结构.结论 超滤结合差速离心法可应用于对EV需求量大的实验.若EV需求量小,则建议直接使用差速离心法,降低EV破碎的风险.
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