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摘要 对长柄扁桃的开放式组培技术进行研究，结果表明：通过9种抑菌剂不同浓度抑菌效果的比较，发现50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂2种抑菌剂效果较好。采用正交试验设计L16（44）研究出适合长柄扁桃开放组培胚培养的抑菌剂浓度组合和适宜的培养基，即75%代森锰锌可湿性粉剂20 mg/L 50%多菌灵可湿性粉剂45 mg/L和1/2MS。
关键词 长柄扁桃；开放式组培；抑菌剂；胚萌发
中图分类号 S662.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）20-0066-01
长柄扁桃（Amygdalus pedunculata Pall.）具有很高的营养价值、药用价值及优良的防风固沙性能，长柄扁桃的果仁在工业方面的应用开发潜力更大[1]。但是由于自然和人为的破坏，长柄扁桃的分布面积日趋减少，已被列为二级濒危植物。长柄扁桃花粉可育性偏低，产种量少，繁殖系数小，移栽不易成活，繁殖速度慢，人工实生繁殖不能满足对这种濒危植物的保护需求。生产上亟需发展长柄扁桃组培快繁技术，以保护长柄扁桃这一珍贵的野生果树资源[2]。传统组培要求严格的环境条件，成本较高，而开放式组织培养可简化培养程序、降低成本[3]。开放式组织培养是通过在培养基中添加抑菌剂，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养。开放式组织培养由于降低了环境要求，减少了操作环节，在设备、场地、能源等方面都显著降低了成本。研究长柄扁桃开放组织培养技术，以便实现低成本的长柄扁桃组培苗规模化和产业化生产。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用长柄扁桃种子的胚为外植体。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的制备。开放式组培的培养基加入蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，pH值调到5.8左右后煮沸，琼脂未凝固前加入抑菌剂，不经高温高压灭菌，充分搅拌培养基，定量分装入洁净的三角瓶中。
1.2.2 抑菌剂的筛选。选取山梨酸钾、利福平、50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂、青霉素、链霉素、氨苄西林钠、羧苄青霉素、硫酸庆大霉素9种抑菌剂，配制抑菌剂浓度分别为0、25、50、100、150、200 mg/L的MS培养基。9种杀菌剂每个浓度梯度各12瓶培养基。在空气中暴露1 h，封口，放在培养室中培养，每组重复3次。每3 d观察其生菌状况，记录培养基的污染情况。
1.2.3 外植体消毒。将长柄扁桃种子的外壳去掉，再用小镊子将种胚取出。按以下流程进行预处理：蒸馏水中浸泡24 h→蒸馏水漂洗3次→75%酒精漂洗30 s→0.1%升汞溶液消毒9～13 min→无菌水清洗4～5次，将胚接种到含有不同浓度杀菌剂的培养基上。暗处培养1周，然后在光下培养，培养温度为25～32 ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为每天12～16 h。
1.2.4 采用正交试验设计探索适合抑菌剂的浓度和胚萌发的培养基。采用L16（44）正交表设计长柄扁桃开放组培胚萌发的试验方案，参试因子为培养基（MS、1/2MS、G、QL）、代森锰锌（5、10、15、20 mg/L）、多菌灵（15、25、35、45 mg/L），进行统计分析，筛选出长柄扁桃开放组培最适合的胚萌发培养基。
2 结果与分析
2.1 不同抑菌剂对培养基污染率的影响
由图1可知，每种抑菌剂随着浓度的增大，培养基污染率逐渐减小。山梨酸钾、青霉素、链霉素、氨苄西林钠、羧苄青霉素、硫酸庆大霉素浓度达200 mg/L时污染较多，抑菌效果差。利福平浓度达200 mg/L时污染率达20%，抑菌效果一般。50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂的浓度分别达到50、25 mg/L时，污染率即降为10%以下，可以看出50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂抑菌效果最好，这一结果与李文英[4]的研究相一致。因此，50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂可作为长柄扁桃开放组织培养的抑菌剂。
2.2 不同培养基、抑菌剂浓度对胚萌发的影响
由表1可知，影响长柄扁桃胚萌发污染率的各因子的主次顺序是75%代森锰锌可湿性粉剂、50%多菌灵可湿性粉剂、培养基，污染率主要受抑菌剂的影响，随着抑菌剂浓度的增大污染率降低。最优的抑菌剂组合为75%代森锰锌可湿性粉剂20 mg/L 50%多菌灵可湿性粉剂45 mg/L。由萌发率的R值和k值大小可知，影响长柄扁桃胚萌发的各因子的主次顺序是培养基、50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂，表明长柄扁桃胚萌发率主要受培养基的影响，以1/2MS为最佳胚萌发培养基，较高的抑菌剂浓度胚萌发率较低。
3 结论与讨论
采用开放式组织培养不需高压灭菌和超净工作台接种，技术环节简化，降低了组培成本[5]。而植物开放式组织培养技术的关键在于找到有效的抑菌剂，在长柄扁桃的开放组培试验过程中，通过对9种抑菌剂不同浓度抑菌效果的比较，发现50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂抑菌效果较好。正交试验结果表明，适合长柄扁桃开放组培胚萌发的抑菌剂浓度组合为75%代森锰锌可湿性粉剂20 mg/L 50%多菌灵可湿性粉剂45 mg/L，适宜的培养基是1/2MS。试验采用一定浓度的多菌灵和代森锰锌抑菌剂组合，有效控制了长柄扁桃的开放组培胚培养的污染，为以后长柄扁桃开放组培的增殖与生根培养奠定了基础。在试验过程中，也发现高的抑菌剂浓度对胚的萌发有抑制作用，还需对抑菌剂的浓度和种类做进一步研究。
4 参考文献
[1] 郭春会，罗梦.沙地濒危植物长柄扁桃特性研究进展[J].西北农林科技大学学报，2005（12）：125-128.
[2] 孙占育，孙志强，郭春会，等.6-BA与IBA对长柄扁桃增殖的影响[J].现代农业科技，2010（7）：126-128.
[3] 崔刚，单文修，秦旭，等.植物开放式组织培养初探[J].山东农业大学学报：自然科学版，2004，35（4）：529-533.
[4] 李文英.百合‘普瑞头’组织培养与开放组培初探[D].哈尔滨：东北林业大学，2012.
[5] 解辉.香蕉开放式组织培养体系研究[D].海口：海南大学，2011.
关键词 长柄扁桃；开放式组培；抑菌剂；胚萌发
中图分类号 S662.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）20-0066-01
长柄扁桃（Amygdalus pedunculata Pall.）具有很高的营养价值、药用价值及优良的防风固沙性能，长柄扁桃的果仁在工业方面的应用开发潜力更大[1]。但是由于自然和人为的破坏，长柄扁桃的分布面积日趋减少，已被列为二级濒危植物。长柄扁桃花粉可育性偏低，产种量少，繁殖系数小，移栽不易成活，繁殖速度慢，人工实生繁殖不能满足对这种濒危植物的保护需求。生产上亟需发展长柄扁桃组培快繁技术，以保护长柄扁桃这一珍贵的野生果树资源[2]。传统组培要求严格的环境条件，成本较高，而开放式组织培养可简化培养程序、降低成本[3]。开放式组织培养是通过在培养基中添加抑菌剂，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养。开放式组织培养由于降低了环境要求，减少了操作环节，在设备、场地、能源等方面都显著降低了成本。研究长柄扁桃开放组织培养技术，以便实现低成本的长柄扁桃组培苗规模化和产业化生产。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用长柄扁桃种子的胚为外植体。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的制备。开放式组培的培养基加入蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，pH值调到5.8左右后煮沸，琼脂未凝固前加入抑菌剂，不经高温高压灭菌，充分搅拌培养基，定量分装入洁净的三角瓶中。
1.2.2 抑菌剂的筛选。选取山梨酸钾、利福平、50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂、青霉素、链霉素、氨苄西林钠、羧苄青霉素、硫酸庆大霉素9种抑菌剂，配制抑菌剂浓度分别为0、25、50、100、150、200 mg/L的MS培养基。9种杀菌剂每个浓度梯度各12瓶培养基。在空气中暴露1 h，封口，放在培养室中培养，每组重复3次。每3 d观察其生菌状况，记录培养基的污染情况。
1.2.3 外植体消毒。将长柄扁桃种子的外壳去掉，再用小镊子将种胚取出。按以下流程进行预处理：蒸馏水中浸泡24 h→蒸馏水漂洗3次→75%酒精漂洗30 s→0.1%升汞溶液消毒9～13 min→无菌水清洗4～5次，将胚接种到含有不同浓度杀菌剂的培养基上。暗处培养1周，然后在光下培养，培养温度为25～32 ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为每天12～16 h。
1.2.4 采用正交试验设计探索适合抑菌剂的浓度和胚萌发的培养基。采用L16（44）正交表设计长柄扁桃开放组培胚萌发的试验方案，参试因子为培养基（MS、1/2MS、G、QL）、代森锰锌（5、10、15、20 mg/L）、多菌灵（15、25、35、45 mg/L），进行统计分析，筛选出长柄扁桃开放组培最适合的胚萌发培养基。
2 结果与分析
2.1 不同抑菌剂对培养基污染率的影响
由图1可知，每种抑菌剂随着浓度的增大，培养基污染率逐渐减小。山梨酸钾、青霉素、链霉素、氨苄西林钠、羧苄青霉素、硫酸庆大霉素浓度达200 mg/L时污染较多，抑菌效果差。利福平浓度达200 mg/L时污染率达20%，抑菌效果一般。50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂的浓度分别达到50、25 mg/L时，污染率即降为10%以下，可以看出50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂抑菌效果最好，这一结果与李文英[4]的研究相一致。因此，50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂可作为长柄扁桃开放组织培养的抑菌剂。
2.2 不同培养基、抑菌剂浓度对胚萌发的影响
由表1可知，影响长柄扁桃胚萌发污染率的各因子的主次顺序是75%代森锰锌可湿性粉剂、50%多菌灵可湿性粉剂、培养基，污染率主要受抑菌剂的影响，随着抑菌剂浓度的增大污染率降低。最优的抑菌剂组合为75%代森锰锌可湿性粉剂20 mg/L 50%多菌灵可湿性粉剂45 mg/L。由萌发率的R值和k值大小可知，影响长柄扁桃胚萌发的各因子的主次顺序是培养基、50%多菌灵可湿性粉剂、75%代森锰锌可湿性粉剂，表明长柄扁桃胚萌发率主要受培养基的影响，以1/2MS为最佳胚萌发培养基，较高的抑菌剂浓度胚萌发率较低。
3 结论与讨论
采用开放式组织培养不需高压灭菌和超净工作台接种，技术环节简化，降低了组培成本[5]。而植物开放式组织培养技术的关键在于找到有效的抑菌剂，在长柄扁桃的开放组培试验过程中，通过对9种抑菌剂不同浓度抑菌效果的比较，发现50%多菌灵可湿性粉剂和75%代森锰锌可湿性粉剂抑菌效果较好。正交试验结果表明，适合长柄扁桃开放组培胚萌发的抑菌剂浓度组合为75%代森锰锌可湿性粉剂20 mg/L 50%多菌灵可湿性粉剂45 mg/L，适宜的培养基是1/2MS。试验采用一定浓度的多菌灵和代森锰锌抑菌剂组合，有效控制了长柄扁桃的开放组培胚培养的污染，为以后长柄扁桃开放组培的增殖与生根培养奠定了基础。在试验过程中，也发现高的抑菌剂浓度对胚的萌发有抑制作用，还需对抑菌剂的浓度和种类做进一步研究。
4 参考文献
[1] 郭春会，罗梦.沙地濒危植物长柄扁桃特性研究进展[J].西北农林科技大学学报，2005（12）：125-128.
[2] 孙占育，孙志强，郭春会，等.6-BA与IBA对长柄扁桃增殖的影响[J].现代农业科技，2010（7）：126-128.
[3] 崔刚，单文修，秦旭，等.植物开放式组织培养初探[J].山东农业大学学报：自然科学版，2004，35（4）：529-533.
[4] 李文英.百合‘普瑞头’组织培养与开放组培初探[D].哈尔滨：东北林业大学，2012.
[5] 解辉.香蕉开放式组织培养体系研究[D].海口：海南大学，2011.