【摘 要】
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研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1(UCP1)基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据.用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度(0、5、20、50和100 μg/mL)鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5(Myf5)、生肌决定因子(MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、生肌调节因子4(MRF4)的表达检测,建立C2C12成肌分
【机 构】
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中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193
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研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1(UCP1)基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据.用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度(0、5、20、50和100 μg/mL)鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5(Myf5)、生肌决定因子(MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、生肌调节因子4(MRF4)的表达检测,建立C2C12成肌分化体系;在成肌分化培养基中添加上述不同浓度的鞘磷脂,诱导分化6d后,通过形态学和Myogenin免疫荧光染色观察肌管的形成及成肌分化标记基因的mRNA表达水平检测,确定鞘磷脂的最佳添加浓度.用筛选出的最佳鞘磷脂添加浓度诱导细胞成肌分化,在2、4和6d收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测周期蛋白相关基因CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表达水平,CCK8法检测诱导2d细胞的活力.结果 发现,与野生型猪相比,UCP1-KI猪背部肌肉组织中总鞘磷脂含量显著增加(P＜0.05);血清鞘磷脂含量差异不显著(P＞0.05);不同浓度鞘磷脂对未分化C2C12细胞的增殖无显著影响(P＞0.05);成肌分化6d后,C2C12细胞形成明显的肌管,成肌分化标记基因My f5、MyoD、Myogenin、MRF4的mRNA和蛋白水平均极显著上调(P＜0.01);与未添加鞘磷脂的对照组相比,20 μg/mL鞘磷脂组有更多肌管形成,Myogenin阳性信号和肌管融合指数均显著增加(P＜0.05),Myogenin、MRF4基因的表达量显著提高(P＜0.05).利用20 μug/mL鞘磷脂诱导细胞分化,在分化2d时,处理组CyclinE、CDK4基因表达量显著高于对照组(P＜0.05),细胞活力也显著高于对照组(P＜0.05);分化6d后,处理组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4基因表达量均显著低于对照组(P＜0.05).本研究结果表明,20 μg/mL鞘磷脂能够提高小鼠肌卫星细胞C2C12分化早期细胞活力和成肌分化效率,可为研究鞘磷脂对骨骼肌生长的影响提供一定的参考.
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