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摘要 为了筛选出一株具有高毒力的蜡蚧轮枝菌菌株，根据已有文献所记载的蜡蚧轮枝菌的培养条件，对一株蜡蚧轮枝菌菌株培养条件进行筛选，在不同接菌量、不同摇床转速、不同碳源和氮源条件下，分别比较了各处理组蜡蚧轮枝菌的产孢数量。结果表明，在接菌量为1%的液体培养基中产孢量最大，同时在培养转速160 r/min的条件下菌株产孢量与其他摇床转速处理差异显著，产孢量为1.46×109个/mL，在第6天供试碳源为葡萄糖的处理产孢量为1.26×109個/mL。菌株在供试氮源为蛋白胨的培养基中产孢量最大，为1.31×109个/mL，与供试氮源为酵母浸粉的处理之间差异显著。在以上条件下，蜡蚧轮枝菌菌株具有生长速度快、产孢量大和菌丝活力高等优点，并为更好地将该菌应用于大田生产提供了崭新的思路。
关键词 蜡蚧轮枝菌;初始接菌量;摇床转速;碳源;氮源
Abstract In order to select one Verticillium lecanii with high virulence strains，based on the existing literature， the culture conditions of V.lecanii strain were screened. Under the conditions of different inoculation quantity，rotating speed of shaking bed，carbon source and introgen source，the sporulation quantity of V.lecannii in earch treatment was compared.The results showed that the spore amount in the liquid medium with the inoculation amount of 1% was the largest.At the same time，the spore yield of the strain was significantly different from that of other shaking bed treatments at the culture speed of 160 r/min.The spore yield was 1.46×109 spore/mL and the spore yield was 1.26×109 spore/mL at 6 d when the carbon source was glucose.The maximum spore yield of the strain in the medium with nitrogen source as protein was significant （1.31×109 spore/mL），which was significantly different from the treatment with nitrogen source as yeast extract.Under the above conditions，the strain had the advantages of rapid growth，large spore production and high fungus filiform vitality，and provided a new idea for better application of the strain in field production and application.
Key words Verticillium lecanii;Initial inoculation amount;Table speed;Carbon source;Nitrogen source
蜡蚧轮枝菌Verticillium lecanii被划分为真菌界半知菌亚门淡色孢科轮枝孢属[1]，广泛分布于世界各地。主要寄生于同翅目昆虫，其中包括叶蝉、蚜虫、烟粉虱、粉蚧[2]等昆虫。同时也寄生在一些侵染植物的病原菌上，如蜡蚧轮枝菌对烟草赤星病病原菌也具有一定拮抗作用，可以显著抑制赤星病病斑的扩散，另外蜡蚧轮枝菌也可抑制包括锈病病原菌、线虫、白粉病病原菌在内的多种病原物。蜡蚧轮枝菌最早用于防治桃蚜[3]，防治效果较为理想。蜡蚧轮枝菌的代谢产物也对桃蚜等同翅目[4]刺吸式口器害虫有防治作用[5]。
伴随着化学农药的普及，人们在防治同翅目害虫时首先使用化学药剂，虽然一开始化学药剂起到了药到虫灭短平快的效果，但药剂防治的弊端也随着时间的推移逐渐暴露出来，环境污染、农业产品农药残留量过高、害虫对农药产生抗性、大范围杀伤天敌等[6]。我国种植业也受到了很大冲击，使得我国烟草、黄瓜和辣椒产量严重下降，每年所造成的经济损失巨大，国家财政收入受到严重影响。
目前生物防治方法已经普遍为人们广泛所接受，具有代表性的方法包括使用昆虫病原菌防治害虫以及利用天敌防治害虫的方法，这些方法不但不会污染自然环境，而且对人类和牲畜没有任何的毒害作用。蜡蚧轮枝菌就是这样一种生物防治真菌，目前已经有多个菌株商品化，市场上有多家公司生产销售蜡蚧轮枝菌的菌株用于防治各种作物上的虫害，是比较受大多数农业劳动者欢迎的生物防治真菌。笔者以一株蜡蚧轮枝菌为研究对象，比较了该菌在不同接菌量、不同摇床转速、不同碳源和不同氮源下的产孢情况，通过产孢量的大小，分析了该菌株的生长状况与各培养条件参数的关系，以期得到对蚜虫具有高致病毒力的蜡蚧轮枝菌菌株，为蜡蚧轮枝菌应用于大田防治蚜虫、烟粉虱等害虫以及赤星病预防提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试菌种 供试蜡蚧轮枝菌菌株分离自四川省攀枝花市米易县新山乡烟叶试验田中的罹患烟粉虱成虫虫体，在安徽农业大学植物保护学院昆虫病理实验室分离保藏。试验前，用接种环挑取一定量孢子接种到SDAY固体培养基上，在25 ℃真菌培养箱中培养7 d，活化备用。 1.2 供试培养基 SDAY液体培养基：葡萄糖4.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母浸粉1.0 g，纯水100 mL。
1.3 最适接菌量的筛选 在无菌操作条件下，把培养7 d的蜡蚧轮枝菌接入SDAY液体培养基的锥形瓶中，在（26.0±0.5）℃、光周期12D∶12L、转速120 r/min的恒温摇床培养7 d，首次接菌后，经过24 h再测算浓度，并将其以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%接菌量接入SDAY液体培养基中，每个接菌量重复3次，在恒温摇床连续培养7 d，使用血球计数板测算孢子浓度。
1.4 最適摇床转速的筛选 光周期定为12D∶12 L，温度为（26.0±0.5） ℃，恒温摇床转速分别设定为100、120、140、160、180 r/min，以1.0%接菌量接入SDAY液体培养基中连续培养7 d，每个摇床转速重复3次，测定方法同“1.3”。
1.5 最适碳源及氮源的筛选 将SDAY培养基中葡萄糖分别用5种碳源（果糖、海藻糖、麦芽糖、木糖、山梨醇）替换使其含碳量相同，配制成6种不同碳源培养基;将SDAY培养基中蛋白胨分别用玉米浆、酵母浸粉、硝酸钠3种氮源替换，使其含氮量相同。配制成4种不同的氮源培养基。培养及测定方法同“1.3”。
1.6 数据处理 试验数据采用DPS软件和Excel软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 接菌量对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响 由表1可知，在使用SDAY液体培养基培养的处理组中，接菌量为2%处理菌株产孢情况与接菌量3%的处理差异不显著。接菌量4%的处理最大产孢量峰值出现在第6天，且最大产孢量与其他处理的最大产孢量差异显著。3%和5%接菌量处理的峰值均出现在第6天，第7天产孢量均出现下降。
2.2 摇床转速对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响
由表2可知，转速100、120、140、160、180 r/min的条件下均可以生长并产孢。转速在100～120 r/min时，转速越高产孢量越大。在转速为160～180 r/min条件下，菌株产孢量随转速增加而减少。蜡蚧轮枝菌菌株在5个摇床转速条件下产孢量存在显著差异。该菌株在160 r/min条件下生长速度最显著，显著高于100 r/min，产孢量最大，在第7天达到峰值，与其他4个处理之间差异显著，其次是140、120、100和180 r/min，160 r/min为该菌株生长最适摇床转速。
2.3 碳源对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响
由表3可知，蜡蚧轮枝菌菌株在以葡萄糖[7]作为碳源的培养基中产孢量最大，为1.25×109个/mL。海藻糖和麦芽糖之间差异不显著。果糖的最大产孢量显著低于其他5个处理产孢量的最大值，其最大产孢量出现在第6天，为9.19×108个/mL。海藻糖与木糖的最大产孢量均出现在第6天，二者最大产孢量之间差异不显著。
2.4 氮源对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响
由表4可知，蜡蚧轮枝菌菌株在供试氮源为蛋白胨的液体培养基中产孢量最大，为1.31×109个/mL，与供试氮源为玉米浆之间差异显著，其次是酵母浸粉和硝酸钠。产孢量最低的处理为酵母浸粉，其最大产孢量为8.47×108个/mL，显著低于供试氮源为蛋白胨的处理。玉米浆与硝酸钠处理的最大产孢量差异不显著。
3 结论与讨论
该研究结果表明，分离出的蜡蚧轮枝菌菌株的适应能力强，摇床转速、接菌量、碳源及氮源等培养条件均不同程度地影响菌株的产孢量及生长速率，这与李国霞等[8]研究结果相符。初始接菌量对蜡蚧轮枝菌的产孢量也有显著影响，在SDAY液体培养基的处理组中，筛选出的供试菌株在接菌量5%的条件下的处理效果显著，这说明初始接菌量与蜡蚧轮枝菌的活性及产孢量有关，这与王联德等[9]的研究结果一致。
摇床转速也在一定程度上影响菌株的产孢量，摇床转速为120 r/min的处理菌株产孢量与其他处理差异显著。而摇床转速为100 r/min的处理菌株产孢量显著低于其他处理。碳源和氮源直接影响蜡蚧轮枝菌的生长状况和产孢量。通常情况下，在培养蜡蚧轮枝菌过程中选用的碳源一般是葡萄糖。该试验结果表明，在接菌量相同的条件下，蜡蚧轮枝菌在供试碳源为葡萄糖处理中生长状况显著。这与高利[10]关于葡萄糖有利于蜡蚧轮枝菌生长的研究相符。在供试碳源为麦芽糖液体培养基中，产孢量较显著，第7天产孢量达1.06×109个/mL，这与张召荣等[11]的研究相符。在氮源培养基中，该菌株在蛋白胨中生长状况较好，与菌株在玉米浆和硝酸钠中生长有显著差异，Mehta 等[12]的研究结果与该试验结果相似。
关于蜡蚧轮枝菌的最适培养条件已经有一些报道，综合前人的报道，该试验从供试培养基初始接菌量、摇床转速、碳源和氮源4个方面进行研究。产孢量反映了蜡蚧轮枝菌菌株的生长状况，产孢量越大，培养条件越适宜，菌株活性也越强。该试验筛选出的各最适培养条件，均使蜡蚧轮枝菌表现出较强的活力和良好的培养性状，说明以上培养条件可以使蜡蚧轮枝菌保持良好生长活性，该试验结果为工业化生产提供了理论依据。蜡蚧轮枝菌菌株培养条件的优化在烟粉虱、蚜虫等重要害虫及赤星病等真菌性病害的生物防治上具有一定的应用发展潜力。
参考文献
[1] 蒲蛰龙，李增智.昆虫真菌学[M].合肥：安徽科学技术出版社，1996：359-360.
[2] 方大琳.4株蜡蚧轮枝菌对扶桑绵粉蚧的致病力测定[J].福建林业，2018（1）：42-45，48.
[3] 罗小刚.一种重要的昆虫病原真菌——蜡蚧轮枝菌V.lecanii[J].贵州农业科学，1988（1）：57-64.
[4] 雷朝亮，荣秀兰.普通昆虫学[M].北京：中国农业出版社，2003：184-191.
[5] 陈吉棣.蜡蚧轮枝菌及其在生防中的应用[J].生物防治通报，1985，1（4）：32-38.
[6] 周晓榕，高翔，王建国，等.营养和农药对蜡蚧轮枝菌生长发育的影响[J].植物保护，2006，32（5）：23-25.
[7] 刘春来，王爽，李新民，等.蜡蚧轮枝菌的碳·氮营养源研究[J].安徽农业科学，2013，41（32）：12595-12596，12599.
[8] 李国霞，严毓骅，王丽英.温度和营养对北京地区蜡蚧轮枝菌生长发育的影响[J].生物防治通报，1991，7（3）：115-119.
[9] 王联德，王雪芹.蜡蚧轮枝菌对茶蚜的侵染模型[J].武夷科学，2011，27（00）：69-73.
[10] 高利.液体与固体培养几种生防真菌的营养研究[J].中国生物防治，2009，25（4）：322-327.
[11] 张召荣，张艳军，谢明.一株来自热带地区蜡蚧菌的鉴定、生物学特性及其对烟粉虱的致病力[J].中国生物防治学报，2015，31（1）：64-70.
[12] MEHTA J，KAUSHAL N，SEN P，et al.Impact of carbon & nitrongen sources on the Verticillium lecanii and Metarhizium anisopliaeEntomopathogenic fungi[J].European journal of experimental biology，2012，2（4）：1278-1283.
关键词 蜡蚧轮枝菌;初始接菌量;摇床转速;碳源;氮源
Abstract In order to select one Verticillium lecanii with high virulence strains，based on the existing literature， the culture conditions of V.lecanii strain were screened. Under the conditions of different inoculation quantity，rotating speed of shaking bed，carbon source and introgen source，the sporulation quantity of V.lecannii in earch treatment was compared.The results showed that the spore amount in the liquid medium with the inoculation amount of 1% was the largest.At the same time，the spore yield of the strain was significantly different from that of other shaking bed treatments at the culture speed of 160 r/min.The spore yield was 1.46×109 spore/mL and the spore yield was 1.26×109 spore/mL at 6 d when the carbon source was glucose.The maximum spore yield of the strain in the medium with nitrogen source as protein was significant （1.31×109 spore/mL），which was significantly different from the treatment with nitrogen source as yeast extract.Under the above conditions，the strain had the advantages of rapid growth，large spore production and high fungus filiform vitality，and provided a new idea for better application of the strain in field production and application.
Key words Verticillium lecanii;Initial inoculation amount;Table speed;Carbon source;Nitrogen source
蜡蚧轮枝菌Verticillium lecanii被划分为真菌界半知菌亚门淡色孢科轮枝孢属[1]，广泛分布于世界各地。主要寄生于同翅目昆虫，其中包括叶蝉、蚜虫、烟粉虱、粉蚧[2]等昆虫。同时也寄生在一些侵染植物的病原菌上，如蜡蚧轮枝菌对烟草赤星病病原菌也具有一定拮抗作用，可以显著抑制赤星病病斑的扩散，另外蜡蚧轮枝菌也可抑制包括锈病病原菌、线虫、白粉病病原菌在内的多种病原物。蜡蚧轮枝菌最早用于防治桃蚜[3]，防治效果较为理想。蜡蚧轮枝菌的代谢产物也对桃蚜等同翅目[4]刺吸式口器害虫有防治作用[5]。
伴随着化学农药的普及，人们在防治同翅目害虫时首先使用化学药剂，虽然一开始化学药剂起到了药到虫灭短平快的效果，但药剂防治的弊端也随着时间的推移逐渐暴露出来，环境污染、农业产品农药残留量过高、害虫对农药产生抗性、大范围杀伤天敌等[6]。我国种植业也受到了很大冲击，使得我国烟草、黄瓜和辣椒产量严重下降，每年所造成的经济损失巨大，国家财政收入受到严重影响。
目前生物防治方法已经普遍为人们广泛所接受，具有代表性的方法包括使用昆虫病原菌防治害虫以及利用天敌防治害虫的方法，这些方法不但不会污染自然环境，而且对人类和牲畜没有任何的毒害作用。蜡蚧轮枝菌就是这样一种生物防治真菌，目前已经有多个菌株商品化，市场上有多家公司生产销售蜡蚧轮枝菌的菌株用于防治各种作物上的虫害，是比较受大多数农业劳动者欢迎的生物防治真菌。笔者以一株蜡蚧轮枝菌为研究对象，比较了该菌在不同接菌量、不同摇床转速、不同碳源和不同氮源下的产孢情况，通过产孢量的大小，分析了该菌株的生长状况与各培养条件参数的关系，以期得到对蚜虫具有高致病毒力的蜡蚧轮枝菌菌株，为蜡蚧轮枝菌应用于大田防治蚜虫、烟粉虱等害虫以及赤星病预防提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试菌种 供试蜡蚧轮枝菌菌株分离自四川省攀枝花市米易县新山乡烟叶试验田中的罹患烟粉虱成虫虫体，在安徽农业大学植物保护学院昆虫病理实验室分离保藏。试验前，用接种环挑取一定量孢子接种到SDAY固体培养基上，在25 ℃真菌培养箱中培养7 d，活化备用。 1.2 供试培养基 SDAY液体培养基：葡萄糖4.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母浸粉1.0 g，纯水100 mL。
1.3 最适接菌量的筛选 在无菌操作条件下，把培养7 d的蜡蚧轮枝菌接入SDAY液体培养基的锥形瓶中，在（26.0±0.5）℃、光周期12D∶12L、转速120 r/min的恒温摇床培养7 d，首次接菌后，经过24 h再测算浓度，并将其以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%接菌量接入SDAY液体培养基中，每个接菌量重复3次，在恒温摇床连续培养7 d，使用血球计数板测算孢子浓度。
1.4 最適摇床转速的筛选 光周期定为12D∶12 L，温度为（26.0±0.5） ℃，恒温摇床转速分别设定为100、120、140、160、180 r/min，以1.0%接菌量接入SDAY液体培养基中连续培养7 d，每个摇床转速重复3次，测定方法同“1.3”。
1.5 最适碳源及氮源的筛选 将SDAY培养基中葡萄糖分别用5种碳源（果糖、海藻糖、麦芽糖、木糖、山梨醇）替换使其含碳量相同，配制成6种不同碳源培养基;将SDAY培养基中蛋白胨分别用玉米浆、酵母浸粉、硝酸钠3种氮源替换，使其含氮量相同。配制成4种不同的氮源培养基。培养及测定方法同“1.3”。
1.6 数据处理 试验数据采用DPS软件和Excel软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 接菌量对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响 由表1可知，在使用SDAY液体培养基培养的处理组中，接菌量为2%处理菌株产孢情况与接菌量3%的处理差异不显著。接菌量4%的处理最大产孢量峰值出现在第6天，且最大产孢量与其他处理的最大产孢量差异显著。3%和5%接菌量处理的峰值均出现在第6天，第7天产孢量均出现下降。
2.2 摇床转速对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响
由表2可知，转速100、120、140、160、180 r/min的条件下均可以生长并产孢。转速在100～120 r/min时，转速越高产孢量越大。在转速为160～180 r/min条件下，菌株产孢量随转速增加而减少。蜡蚧轮枝菌菌株在5个摇床转速条件下产孢量存在显著差异。该菌株在160 r/min条件下生长速度最显著，显著高于100 r/min，产孢量最大，在第7天达到峰值，与其他4个处理之间差异显著，其次是140、120、100和180 r/min，160 r/min为该菌株生长最适摇床转速。
2.3 碳源对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响
由表3可知，蜡蚧轮枝菌菌株在以葡萄糖[7]作为碳源的培养基中产孢量最大，为1.25×109个/mL。海藻糖和麦芽糖之间差异不显著。果糖的最大产孢量显著低于其他5个处理产孢量的最大值，其最大产孢量出现在第6天，为9.19×108个/mL。海藻糖与木糖的最大产孢量均出现在第6天，二者最大产孢量之间差异不显著。
2.4 氮源对蜡蚧轮枝菌生长状况的影响
由表4可知，蜡蚧轮枝菌菌株在供试氮源为蛋白胨的液体培养基中产孢量最大，为1.31×109个/mL，与供试氮源为玉米浆之间差异显著，其次是酵母浸粉和硝酸钠。产孢量最低的处理为酵母浸粉，其最大产孢量为8.47×108个/mL，显著低于供试氮源为蛋白胨的处理。玉米浆与硝酸钠处理的最大产孢量差异不显著。
3 结论与讨论
该研究结果表明，分离出的蜡蚧轮枝菌菌株的适应能力强，摇床转速、接菌量、碳源及氮源等培养条件均不同程度地影响菌株的产孢量及生长速率，这与李国霞等[8]研究结果相符。初始接菌量对蜡蚧轮枝菌的产孢量也有显著影响，在SDAY液体培养基的处理组中，筛选出的供试菌株在接菌量5%的条件下的处理效果显著，这说明初始接菌量与蜡蚧轮枝菌的活性及产孢量有关，这与王联德等[9]的研究结果一致。
摇床转速也在一定程度上影响菌株的产孢量，摇床转速为120 r/min的处理菌株产孢量与其他处理差异显著。而摇床转速为100 r/min的处理菌株产孢量显著低于其他处理。碳源和氮源直接影响蜡蚧轮枝菌的生长状况和产孢量。通常情况下，在培养蜡蚧轮枝菌过程中选用的碳源一般是葡萄糖。该试验结果表明，在接菌量相同的条件下，蜡蚧轮枝菌在供试碳源为葡萄糖处理中生长状况显著。这与高利[10]关于葡萄糖有利于蜡蚧轮枝菌生长的研究相符。在供试碳源为麦芽糖液体培养基中，产孢量较显著，第7天产孢量达1.06×109个/mL，这与张召荣等[11]的研究相符。在氮源培养基中，该菌株在蛋白胨中生长状况较好，与菌株在玉米浆和硝酸钠中生长有显著差异，Mehta 等[12]的研究结果与该试验结果相似。
关于蜡蚧轮枝菌的最适培养条件已经有一些报道，综合前人的报道，该试验从供试培养基初始接菌量、摇床转速、碳源和氮源4个方面进行研究。产孢量反映了蜡蚧轮枝菌菌株的生长状况，产孢量越大，培养条件越适宜，菌株活性也越强。该试验筛选出的各最适培养条件，均使蜡蚧轮枝菌表现出较强的活力和良好的培养性状，说明以上培养条件可以使蜡蚧轮枝菌保持良好生长活性，该试验结果为工业化生产提供了理论依据。蜡蚧轮枝菌菌株培养条件的优化在烟粉虱、蚜虫等重要害虫及赤星病等真菌性病害的生物防治上具有一定的应用发展潜力。
参考文献
[1] 蒲蛰龙，李增智.昆虫真菌学[M].合肥：安徽科学技术出版社，1996：359-360.
[2] 方大琳.4株蜡蚧轮枝菌对扶桑绵粉蚧的致病力测定[J].福建林业，2018（1）：42-45，48.
[3] 罗小刚.一种重要的昆虫病原真菌——蜡蚧轮枝菌V.lecanii[J].贵州农业科学，1988（1）：57-64.
[4] 雷朝亮，荣秀兰.普通昆虫学[M].北京：中国农业出版社，2003：184-191.
[5] 陈吉棣.蜡蚧轮枝菌及其在生防中的应用[J].生物防治通报，1985，1（4）：32-38.
[6] 周晓榕，高翔，王建国，等.营养和农药对蜡蚧轮枝菌生长发育的影响[J].植物保护，2006，32（5）：23-25.
[7] 刘春来，王爽，李新民，等.蜡蚧轮枝菌的碳·氮营养源研究[J].安徽农业科学，2013，41（32）：12595-12596，12599.
[8] 李国霞，严毓骅，王丽英.温度和营养对北京地区蜡蚧轮枝菌生长发育的影响[J].生物防治通报，1991，7（3）：115-119.
[9] 王联德，王雪芹.蜡蚧轮枝菌对茶蚜的侵染模型[J].武夷科学，2011，27（00）：69-73.
[10] 高利.液体与固体培养几种生防真菌的营养研究[J].中国生物防治，2009，25（4）：322-327.
[11] 张召荣，张艳军，谢明.一株来自热带地区蜡蚧菌的鉴定、生物学特性及其对烟粉虱的致病力[J].中国生物防治学报，2015，31（1）：64-70.
[12] MEHTA J，KAUSHAL N，SEN P，et al.Impact of carbon & nitrongen sources on the Verticillium lecanii and Metarhizium anisopliaeEntomopathogenic fungi[J].European journal of experimental biology，2012，2（4）：1278-1283.