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摘要：以辽宁省产五味子为研究对象，在7—9月果实发育期采样，测定不同生长阶段果实的外观性状及主要化学成分变化，用主成分分析方法对不同生长期的五味子品质进行综合评价，并结合产地实际情况确定五味子适宜采收期。结果表明，在整个生长过程中，不同化学成变化趋势不同；木脂素成分在一定时间内呈现先升高后降低的趋势，整体呈现倒“V”形分布，其中8月上旬果实中木脂素成分含量最高；辽宁省产地的五味子适宜采收期在9月上旬。
关键词：五味子；化学成分；动态变化；主成分分析；采收期
中图分类号：S567.01 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0234-05
收稿日期：2014-03-26
基金项目：国家科技重大专项（编号：2013ZX09402202）。
作者简介：安开龙（1988—），男，甘肃武威人，硕士，主要从事中药材质量控制研究。E-mail：2011104185@njau.edu.cn。
通信作者：郭巧生，博士，教授，主要从事药用植物资源开发研究。E-mail：gqs@njau.edu.cn。五味子[Schisandra chinensis （ Turcz.） Baill.] 为五味子属多年生左旋落叶木质藤本植物，是我国温带针叶阔叶混交林带区域和暖温带落叶阔叶林区域经历第四纪冰川时期而保留下来的第三纪古老植物种之一[1]，主要分布于中国东北和华北、朝鲜半岛、日本及俄罗斯远东等地区，其干燥成熟果实作药用已有2 000多年的历史。目前，北五味子被广泛用于制药、造酒、饮料生产业中，是具有重要经济价值的药用植物，开发利用前景极为广阔。我国五味子主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西、宁夏、甘肃9省（区）[2]。
近年来，关于菘蓝、菊花、山茱萸、中华苦荬菜等生长发育和次生代谢合成积累、成分积累动态研究已有报道，对指导药材采收、科学种植及资源合理利用具有一定意义。但是，有关五味子果实的生长发育及次生代谢物合成积累动态研究未见有文献报道。因此，本试验通过对五味子果实期间外观发育和主要化学成分含量的动态变化进行研究，明确五味子果实期间主要化学成分的变化动态，以期为提高产地药材产品品质提供科学依据，为北五味子药材质量标准的建立、控制及合理开发利用提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料
材料采自辽宁省新宾县，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为五味子。在五味子开花坐果到果实成熟整个发育过程中共取样6次。在首次采样时，随机选择生长状况良好、长势一致、无病害植株做好标记；后续采样时，从标记植株上随机剪取无病虫害果穗放入低温样品箱，尽快带回实验室；将样品混匀，洗净、擦干，随机选取测定。
1.2仪器与试剂
Waters alliance 2695 型高效液相色谱单元、Waters 2489 型紫外/可见光检测器、Empower 2 工作站，美国Waters公司生产；XS 105型电子分析天平、AL 204 型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；KQ-5200型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；WK 1000A高速粉碎机，山东省青州市精诚医药装备有限公司生产；DGG 101-1BS电热鼓风干燥箱，天津市天宇实验仪器有限公司生产；Milli-Q A10超纯水系统，美国Millipore公司生产；pH计、磁力搅拌机、游标卡尺、常规玻璃仪器等，国产。
五味子醇甲（批号：110857-200709，纯度≥99%）、五味子酯甲（批号：111529-200503，纯度≥99%）、五味子甲素（批号110764-200609，纯度≥98%）、五味子乙素（批号110765-200710，纯度≥99%）对照品，购自中国食品药品检定研究院；五味子醇乙、五味子丙素、5-羟甲基糠醛（5-HMF）对照品，纯度≥98%，购自天津马克生物技术有限公司；戈米辛D、戈米辛G、戈米辛J，纯度≥98%，购自天津一方科技有限公司；当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q，纯度≥98%，自制。分析纯维生素C，国产；L-苹果酸、柠檬酸对照品，美国Supelco公司；莽草酸对照品，纯度大于98.8%，批号：14800，上海晶纯试剂有限公司；分析纯磷酸二氢钾、草酸，天津市风船试剂科技有限公司；色谱纯磷酸，天津市光复精细化工研究所；硫酸（优级纯），国产；蒽酮，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯乙腈、甲醇，纯度≥99.9%，德国Merck集团。
1.3试验方法
1.3.1五味子果实生长发育分别随机抽取50个五味子鲜果果实和50粒种子。以游标卡尺测定鲜果和种子的最宽处（横径）与最长处（纵径）尺寸；采用量筒排水法，以加入果实或种子前后的水位差分别作为鲜果和种子的体积；以电子天平测定鲜果果实和种子的质量（鲜质量）及果实和种子烘至恒重时的质量（干质量）。
1.3.2木脂素类成分测定采用液相色谱仪进行测定，色谱条件[3]为：Waters alliance 2695 型高效液相色谱单元，Waters 2489 型紫外/可见光检测器，Empower 2工作站，Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；柱温为30 ℃，检测波长为218 nm，流速为 1 mL/min，进样量为10 μL。结果如图1所示。
1.3.3酸类成分测定维生素C、L-苹果酸、莽草酸、柠檬酸含量测定采用液相色谱仪。维生素C含量测定的色谱条件：PrevailTM Organic Acid色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为01%草酸，等度洗脱；流速为1 mL/min，检测波长为244 nm，柱温为30 ℃。结果如图2所示。L-苹果酸、莽草酸、柠檬酸含量测定的色谱条件：PrevailTM Organic Acid色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液，用一定浓度磷酸调节pH值为3.0，等度洗脱；流速为 1 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃。结果如图3所示。总酸含量采用电位滴定法测定。 1.3.4总糖含量测定总糖含量采用硫酸-蒽酮比色法测定。
1.3.55-羟甲基糠醛（5-HMF）测定取4份10 g五味子鲜果匀浆，分别加水20 mL，进行以下处理：（1）密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h；（2）加入定量5-HMF标准品，密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h；（3）密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h，再超声提取40 min；（4）加入定量5-HMF标准品，密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h，再超声提取40 min。采用液相色谱仪对提取液进行测定，色谱条件为：Diamonsil C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈 ∶水=8 ∶92，等度洗脱；流速为 1 mL/min，检测波长为284 nm，柱温为30 ℃。
1.3.6不同生长期五味子综合评价选择与五味子产量和功效密切相关的果实与种子干质量、纵横径、体积及木脂素类、总糖、有机酸等成分含量共26个指标，建立五味子不同生长期综合评价体系，运用主成分分析方法对五味子不同生长期样品进行多指标分析。
2结果与分析
2.1五味子果实与种子的生长发育
2.1.1果实生长发育动态由表1可见，在生长期内，果实的横径、纵径、干质量、鲜质量、体积大部分都呈现不断增加的趋势，且除含水量各指标基本在9月中旬达到最大值；果实颜色由绿色或黄绿色逐渐变为红色或鲜红色，其中8月底至9月初为五味子红色变色期；7月中旬，五味子果实横径、纵径分别为采收时（9月15日）的67.2%、74.1%，体积为采收时的55.9%，干质量为采收时的28.3%，6月份的迅速生长对五味子浆果大小有着基础性的作用；8月10日，采收的样品中已有红色出现，但大部分还为黄绿色；8月末，果实已基本变红，但还有少许绿色；9月上旬，果皮红色加深，并伴随果实变软，果实横径、纵径、体积、鲜质量无明显变化。表1五味子鲜果各生长发育阶段果实的外观指标（x±s，n=3）
2.1.2种子生长发育动态由表2可见，种子的横径、纵径、干质量、体积整体上随果实生长发育而增大，含水量在一定时间内逐渐降低。7月上旬，种子的横径、纵径达到采收时的97%，说明种子在坐果后生长很快，在6月末已经基本形成，此时种皮较脆，含水量较高，颜色呈现黄色，其干质量为采收时的32.1%；8月上旬，种子颜色略有加深，基本呈现成熟种子的颜色，且硬度增加，干物质积累迅速，为采收时的70.9%，较7月份增加1倍多，但种子的横径、纵径变化不大；9月上旬，种子干质量为采收时的96%，这说明物质积累已经基本完毕，颜色也已成为成熟种子的颜色，9月5日至15日，种子横径、纵径变化已不明显。表2五味子鲜果种子各生长发育阶段指标（x±s，n=3）
2.2五味子鲜果木脂素类成分含量变化动态
由表3可见，整个生长期内，五味子鲜果木脂素类成分成分呈现先升高后降低或后期略有回升趋势，整体呈现倒“V”形分布；五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子甲素、五味子乙素5种木脂素成分含量相对较高。7月份，各木脂素成分含量已达到一定水平，这是由于木脂素类成分大部分存在于种子中，7月份种子已基本成型；8月初，木脂素各成分含量急剧增加，木脂素各成分含量相对最高；8月末，木脂素含量又有所降低，此时正值五味子红色素形成、果实由绿转红的阶段；9月，不同木脂素成分表现出不同的变化趋势，这可能是由于不同木脂素成分在果实中的生理作用不一样，不同木脂素在果实成熟过程中参与了生理生化反应。表3五味子鲜果木脂素各成分的含量（n=3）
采样日期
（月-日）五味子醇甲（%）戈米辛D（%）戈米辛J（%）五味子醇乙（%）当归酰戈米辛H（%）当归酰戈米辛Q（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.364f0.550.058f1.720.068b1.470.168c0.590.098e1.020.038b1.6308-100.791a1.640.100a1.000.070a1.430.210a0.950.182a1.650.050a1.8608-310.546e0.730.076d1.320.056d1.790.153e1.740.121d1.740.032c1.7409-050.591d1.020.064e1.560.053e1.890.157d0.640.121d0.830.026d1.8409-100.643c1.690.079c1.270.057d1.750.153e1.310.141b0.710.027d1.7009-150.671b0.920.098b1.020.060c1.670.199b0.500.130c0.740.022e1.55采样日期
（月-日）戈米辛G（%）五味子酯甲（%）五味子甲素（%）五味子乙素（%）五味子丙素（%）木脂素总和（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.059b1.690.036e1.860.080e1.250.230e0.870.057b1.751.256e2.6208-100.068a1.470.067a1.490.148a1.350.337a1.480.063a1.592.086a2.2108-310.057c1.750.054b1.740.120c1.670.274c1.460.055c1.811.544d1.1709-050.050d1.830.041c1.580.132b1.520.250d1.870.055c1.791.540d1.3009-100.050d1.680.039d1.420.147a1.360.268c1.120.062a1.611.676c1.7309-150.049d1.740.032f1.660.113d0.880.314b1.830.058b1.571.752b1.47
关键词：五味子；化学成分；动态变化；主成分分析；采收期
中图分类号：S567.01 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0234-05
收稿日期：2014-03-26
基金项目：国家科技重大专项（编号：2013ZX09402202）。
作者简介：安开龙（1988—），男，甘肃武威人，硕士，主要从事中药材质量控制研究。E-mail：2011104185@njau.edu.cn。
通信作者：郭巧生，博士，教授，主要从事药用植物资源开发研究。E-mail：gqs@njau.edu.cn。五味子[Schisandra chinensis （ Turcz.） Baill.] 为五味子属多年生左旋落叶木质藤本植物，是我国温带针叶阔叶混交林带区域和暖温带落叶阔叶林区域经历第四纪冰川时期而保留下来的第三纪古老植物种之一[1]，主要分布于中国东北和华北、朝鲜半岛、日本及俄罗斯远东等地区，其干燥成熟果实作药用已有2 000多年的历史。目前，北五味子被广泛用于制药、造酒、饮料生产业中，是具有重要经济价值的药用植物，开发利用前景极为广阔。我国五味子主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西、宁夏、甘肃9省（区）[2]。
近年来，关于菘蓝、菊花、山茱萸、中华苦荬菜等生长发育和次生代谢合成积累、成分积累动态研究已有报道，对指导药材采收、科学种植及资源合理利用具有一定意义。但是，有关五味子果实的生长发育及次生代谢物合成积累动态研究未见有文献报道。因此，本试验通过对五味子果实期间外观发育和主要化学成分含量的动态变化进行研究，明确五味子果实期间主要化学成分的变化动态，以期为提高产地药材产品品质提供科学依据，为北五味子药材质量标准的建立、控制及合理开发利用提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料
材料采自辽宁省新宾县，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴定为五味子。在五味子开花坐果到果实成熟整个发育过程中共取样6次。在首次采样时，随机选择生长状况良好、长势一致、无病害植株做好标记；后续采样时，从标记植株上随机剪取无病虫害果穗放入低温样品箱，尽快带回实验室；将样品混匀，洗净、擦干，随机选取测定。
1.2仪器与试剂
Waters alliance 2695 型高效液相色谱单元、Waters 2489 型紫外/可见光检测器、Empower 2 工作站，美国Waters公司生产；XS 105型电子分析天平、AL 204 型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；KQ-5200型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；WK 1000A高速粉碎机，山东省青州市精诚医药装备有限公司生产；DGG 101-1BS电热鼓风干燥箱，天津市天宇实验仪器有限公司生产；Milli-Q A10超纯水系统，美国Millipore公司生产；pH计、磁力搅拌机、游标卡尺、常规玻璃仪器等，国产。
五味子醇甲（批号：110857-200709，纯度≥99%）、五味子酯甲（批号：111529-200503，纯度≥99%）、五味子甲素（批号110764-200609，纯度≥98%）、五味子乙素（批号110765-200710，纯度≥99%）对照品，购自中国食品药品检定研究院；五味子醇乙、五味子丙素、5-羟甲基糠醛（5-HMF）对照品，纯度≥98%，购自天津马克生物技术有限公司；戈米辛D、戈米辛G、戈米辛J，纯度≥98%，购自天津一方科技有限公司；当归酰戈米辛H、当归酰戈米辛Q，纯度≥98%，自制。分析纯维生素C，国产；L-苹果酸、柠檬酸对照品，美国Supelco公司；莽草酸对照品，纯度大于98.8%，批号：14800，上海晶纯试剂有限公司；分析纯磷酸二氢钾、草酸，天津市风船试剂科技有限公司；色谱纯磷酸，天津市光复精细化工研究所；硫酸（优级纯），国产；蒽酮，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯乙腈、甲醇，纯度≥99.9%，德国Merck集团。
1.3试验方法
1.3.1五味子果实生长发育分别随机抽取50个五味子鲜果果实和50粒种子。以游标卡尺测定鲜果和种子的最宽处（横径）与最长处（纵径）尺寸；采用量筒排水法，以加入果实或种子前后的水位差分别作为鲜果和种子的体积；以电子天平测定鲜果果实和种子的质量（鲜质量）及果实和种子烘至恒重时的质量（干质量）。
1.3.2木脂素类成分测定采用液相色谱仪进行测定，色谱条件[3]为：Waters alliance 2695 型高效液相色谱单元，Waters 2489 型紫外/可见光检测器，Empower 2工作站，Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；柱温为30 ℃，检测波长为218 nm，流速为 1 mL/min，进样量为10 μL。结果如图1所示。
1.3.3酸类成分测定维生素C、L-苹果酸、莽草酸、柠檬酸含量测定采用液相色谱仪。维生素C含量测定的色谱条件：PrevailTM Organic Acid色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为01%草酸，等度洗脱；流速为1 mL/min，检测波长为244 nm，柱温为30 ℃。结果如图2所示。L-苹果酸、莽草酸、柠檬酸含量测定的色谱条件：PrevailTM Organic Acid色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液，用一定浓度磷酸调节pH值为3.0，等度洗脱；流速为 1 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃。结果如图3所示。总酸含量采用电位滴定法测定。 1.3.4总糖含量测定总糖含量采用硫酸-蒽酮比色法测定。
1.3.55-羟甲基糠醛（5-HMF）测定取4份10 g五味子鲜果匀浆，分别加水20 mL，进行以下处理：（1）密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h；（2）加入定量5-HMF标准品，密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h；（3）密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h，再超声提取40 min；（4）加入定量5-HMF标准品，密封于4 ℃冰箱中，冷浸提取5-HMF 24 h，再超声提取40 min。采用液相色谱仪对提取液进行测定，色谱条件为：Diamonsil C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈 ∶水=8 ∶92，等度洗脱；流速为 1 mL/min，检测波长为284 nm，柱温为30 ℃。
1.3.6不同生长期五味子综合评价选择与五味子产量和功效密切相关的果实与种子干质量、纵横径、体积及木脂素类、总糖、有机酸等成分含量共26个指标，建立五味子不同生长期综合评价体系，运用主成分分析方法对五味子不同生长期样品进行多指标分析。
2结果与分析
2.1五味子果实与种子的生长发育
2.1.1果实生长发育动态由表1可见，在生长期内，果实的横径、纵径、干质量、鲜质量、体积大部分都呈现不断增加的趋势，且除含水量各指标基本在9月中旬达到最大值；果实颜色由绿色或黄绿色逐渐变为红色或鲜红色，其中8月底至9月初为五味子红色变色期；7月中旬，五味子果实横径、纵径分别为采收时（9月15日）的67.2%、74.1%，体积为采收时的55.9%，干质量为采收时的28.3%，6月份的迅速生长对五味子浆果大小有着基础性的作用；8月10日，采收的样品中已有红色出现，但大部分还为黄绿色；8月末，果实已基本变红，但还有少许绿色；9月上旬，果皮红色加深，并伴随果实变软，果实横径、纵径、体积、鲜质量无明显变化。表1五味子鲜果各生长发育阶段果实的外观指标（x±s，n=3）
2.1.2种子生长发育动态由表2可见，种子的横径、纵径、干质量、体积整体上随果实生长发育而增大，含水量在一定时间内逐渐降低。7月上旬，种子的横径、纵径达到采收时的97%，说明种子在坐果后生长很快，在6月末已经基本形成，此时种皮较脆，含水量较高，颜色呈现黄色，其干质量为采收时的32.1%；8月上旬，种子颜色略有加深，基本呈现成熟种子的颜色，且硬度增加，干物质积累迅速，为采收时的70.9%，较7月份增加1倍多，但种子的横径、纵径变化不大；9月上旬，种子干质量为采收时的96%，这说明物质积累已经基本完毕，颜色也已成为成熟种子的颜色，9月5日至15日，种子横径、纵径变化已不明显。表2五味子鲜果种子各生长发育阶段指标（x±s，n=3）
2.2五味子鲜果木脂素类成分含量变化动态
由表3可见，整个生长期内，五味子鲜果木脂素类成分成分呈现先升高后降低或后期略有回升趋势，整体呈现倒“V”形分布；五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子甲素、五味子乙素5种木脂素成分含量相对较高。7月份，各木脂素成分含量已达到一定水平，这是由于木脂素类成分大部分存在于种子中，7月份种子已基本成型；8月初，木脂素各成分含量急剧增加，木脂素各成分含量相对最高；8月末，木脂素含量又有所降低，此时正值五味子红色素形成、果实由绿转红的阶段；9月，不同木脂素成分表现出不同的变化趋势，这可能是由于不同木脂素成分在果实中的生理作用不一样，不同木脂素在果实成熟过程中参与了生理生化反应。表3五味子鲜果木脂素各成分的含量（n=3）
采样日期
（月-日）五味子醇甲（%）戈米辛D（%）戈米辛J（%）五味子醇乙（%）当归酰戈米辛H（%）当归酰戈米辛Q（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.364f0.550.058f1.720.068b1.470.168c0.590.098e1.020.038b1.6308-100.791a1.640.100a1.000.070a1.430.210a0.950.182a1.650.050a1.8608-310.546e0.730.076d1.320.056d1.790.153e1.740.121d1.740.032c1.7409-050.591d1.020.064e1.560.053e1.890.157d0.640.121d0.830.026d1.8409-100.643c1.690.079c1.270.057d1.750.153e1.310.141b0.710.027d1.7009-150.671b0.920.098b1.020.060c1.670.199b0.500.130c0.740.022e1.55采样日期
（月-日）戈米辛G（%）五味子酯甲（%）五味子甲素（%）五味子乙素（%）五味子丙素（%）木脂素总和（%）含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD含量RSD07-120.059b1.690.036e1.860.080e1.250.230e0.870.057b1.751.256e2.6208-100.068a1.470.067a1.490.148a1.350.337a1.480.063a1.592.086a2.2108-310.057c1.750.054b1.740.120c1.670.274c1.460.055c1.811.544d1.1709-050.050d1.830.041c1.580.132b1.520.250d1.870.055c1.791.540d1.3009-100.050d1.680.039d1.420.147a1.360.268c1.120.062a1.611.676c1.7309-150.049d1.740.032f1.660.113d0.880.314b1.830.058b1.571.752b1.47