耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达

• 作 者: 何淑雅 杨奇 王茹静 肖方竹 王五洲 唐艳 蒋雨薇 马云
• 机 构: 421001 衡阳，南华大学生物化学与分子生物学教研室；421001 衡阳，南华大学公共卫生学院放射医学教研室,421001 衡阳，南华大学生物化学与分子生物学教研室,421002，衡阳市第一人民医院
• 出 处: 国际放射医学核医学杂志
• 发表日期: 2017年41期
• 关键词: 耐辐射奇球菌 辐射 pprM基因 293T细胞

目的

扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM，构建pEGFP-C1-pprM重组载体，转入293T细胞并表达PprM蛋白，为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础。

方法

以无任何突变的pGEX-6p-1-pprM重组质粒为模版，设计引物PCR扩增pprM基因，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段，EcoR I、BamH I双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1，将双酶切产物进行连接，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的Luria-Bertani（LB）固体培养基上进行筛选，所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR，EcoR I、BamH I双酶切及测序鉴定。通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞，倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达。裂解细胞抽提蛋白，Western blot进一步验证PprM蛋白的表达。

结果

菌落PCR结果及双酶切结果显示，在400 bp左右处有一条明显的目的条带，测序结果显示碱基序列与原基因序列一致，载体构建成功。荧光拍照结果显示，pEGFP-C1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白；Western blot结果显示在40×10³处有融合蛋白表达。

结论

笔者成功将所构pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞，并表达相应蛋白，为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础。