【摘 要】
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目的构建抑制大鼠Wnt5a基因表达的重组质粒,达到抑制H157细胞Wnt5a表达的目的。方法根据大鼠Wnt5a的基因序列,设计合成含有发夹结构的2条寡核苷酸片段,经退火形成双链后克隆
【机 构】
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第三军医大学西南医院呼吸科,第三军医大学分子遗传教研室
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目的构建抑制大鼠Wnt5a基因表达的重组质粒,达到抑制H157细胞Wnt5a表达的目的。方法根据大鼠Wnt5a的基因序列,设计合成含有发夹结构的2条寡核苷酸片段,经退火形成双链后克隆至PAVU6+27载体质粒中,对阳性重组子进行酶切和测序鉴定后转染正常H157细胞,并采用West-ern blot检测Wnt5a蛋白水平表达的变化。结果重组质粒经双酶切后,有目的条带出现,提示Wnt5a干扰片断已克隆至PAVU6+27载体质粒中,DNA测序结果显示插入序列与预先设计完全一致。重组质粒转染H157细胞后经G418筛选,成功获得阳性克隆,Western blot结果显示Wnt5a的蛋白水平表达显著下降。结论成功构建Wnt5a基因RNA干扰表达质粒,明显抑制H157细胞中Wnt5a表达,这为深入研究该基因在非小细胞肺癌发生及侵袭转移中的作用奠定了基础。
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