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摘要 以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板，利用PCR方法，扩增出耐盐基因Hal1，测序表明该基因全长为885个核苷酸，与已发表的序列NC_001148比较，同源性99.3%。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间，构建表达载体pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为植物表达载体的构建打下基础。
关键词 耐盐性；Hal1基因；克隆
中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）07-0243-02
Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid
SHEN Yan1，2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2
（1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences，Shanghai 200233；
2 School of life Sciences，Shanghai University）
Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template，Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes，then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence，which provided a foundation of the construction of plant expression vector.
Key words Salt tolerance；Hal1 gene；Cloning
随着全球水资源危机以及土壤盐化问题的加剧，盐胁迫已经成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素[1]。目前，全世界大约有20%的农业用地的盐碱化程度在不断加重，预计到2050年，将会有超过50%的耕地会变得盐碱化[2]。在当前世界人口急剧增长、食品供给增长相对缓慢的情形下，只有采取一定的措施应对日趋严重的环境压力，才能确保人类的食品安全，维持农业生产的可持续发展。为了达到这一目标，就必须了解盐胁迫对植物生长发育的影响，弄清植物耐盐的机制，并通过农业和生物技术手段改良农作物，以增强它们的耐盐性，使其最终为人类的生产和生活服务。耐盐基因Hal1最初来源于啤酒酵母的第16号染色体，具有提高细胞中K 含量，降低Na 含量，也就是提高K /Na 的比率[3，4]，从而可以提高细胞耐盐性的作用。本研究成功克隆了耐盐基因Hal1，并将它连接到pYES2表达载体上，测序表明其与已发表的序列比较，同源性99.3%，构建重组质粒pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为下一步利用该基因提高生物的耐盐水平提供了技术支持。
2 结果与分析
2.1 Hal1基因的PCR扩增
利用引物（P1，P2），以酿酒酵母基因组总DNA为模板，经PCR扩增得到了1条900bp左右的单一条带，与预期结果一致（见图1）。
2.2 Hal1基因的克隆
将上述PCR产物酶切回收与pYES2连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将随机挑取的菌落扩增后提取质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切鉴定，第3号克隆酶切后电泳得到约900bp大小的片断（见图2）。
2.3 重组质粒pYES2-Hal1序列测定
进而将3号克隆测序，结果显示，该核苷酸序列与Genbank数据库已报道的序列相比，同源性为99.3%（见图3）。
3 结论与讨论
酿酒酵母BWG1-7A具有较强的耐盐能力，可在含有7%NaCl的YPD培养基中生长。本试验通过PCR技术，成功地从其DNA中克隆到耐盐基因Hal1。测定的阳性克隆序列，与GenBank上公布的Hal1基因相比较，其核苷酸同源性为99.3%。与已发表的序列同源，将为Hal1基因植物表达载体的构建和转化提供有力保障。
酵母菌的遗传物质结构、基因表达和调控过程等都与高等生物具有一致性，因此已将其作为一种研究农作物耐盐机制的模式生物得到广泛应用[6]。本研究采用的酿酒酵母，是分离耐盐基因的有效模型，有助于高等植物耐盐分子机理的研究，推动抗渗透胁迫工程的发展。
盐碱地是巨大的潜在资源，绿化盐碱地是扩大耕地面积，进一步发展农业生产、改善生态环境的重要措施。利用基因工程手段培育能在盐碱地上种植的林木，是利用盐碱地的一条经济而有效的途径。酿酒酵母Hal1基因在盐胁迫下能与促进Na 外排的ENA1基因及其他转运系统协同作用保持细胞内低的Na /K 比，以减轻Na 毒害，因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力[3]。
4 参考文献
[1] 周和平，张立新，禹锋，等.我国盐碱地改良技术综述及展望[J].现代农业科技，2007（11）：159-164.
[2]V INOCUR B，ALTMAN A. Recent advances in engineering p lant tolerance to a biotic stress： achievements and lim-itations[J].Current Opinion in Biotech-nology，2005（16）：123-132.
[3] R GAXIOLA，IF DE LARRINOA，JM Villalba，et al.A novel and conserved salt-induced protein is an important determinant of salt tolerance in yeast[J].EMBO，1992，11（9）：3157-3164.
[4] MARQUEZ JA，SERRANO R.Multiple transduction pathways regulate the sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt stress in yeast[J]. FEBS letters，1996（382）：89-92.
[5] 亚当斯A，戈特施林D E，凯泽C A. 酵母遗传学方法实验指南[M].刘子铎，译.北京：科学出版社，1998.
[6] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al. T ransfer of the yeast salt to lerance gene HAL 1 to cucum isme cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Res，1997，6（1）：41-50.
关键词 耐盐性；Hal1基因；克隆
中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）07-0243-02
Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid
SHEN Yan1，2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2
（1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences，Shanghai 200233；
2 School of life Sciences，Shanghai University）
Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template，Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes，then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence，which provided a foundation of the construction of plant expression vector.
Key words Salt tolerance；Hal1 gene；Cloning
随着全球水资源危机以及土壤盐化问题的加剧，盐胁迫已经成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素[1]。目前，全世界大约有20%的农业用地的盐碱化程度在不断加重，预计到2050年，将会有超过50%的耕地会变得盐碱化[2]。在当前世界人口急剧增长、食品供给增长相对缓慢的情形下，只有采取一定的措施应对日趋严重的环境压力，才能确保人类的食品安全，维持农业生产的可持续发展。为了达到这一目标，就必须了解盐胁迫对植物生长发育的影响，弄清植物耐盐的机制，并通过农业和生物技术手段改良农作物，以增强它们的耐盐性，使其最终为人类的生产和生活服务。耐盐基因Hal1最初来源于啤酒酵母的第16号染色体，具有提高细胞中K 含量，降低Na 含量，也就是提高K /Na 的比率[3，4]，从而可以提高细胞耐盐性的作用。本研究成功克隆了耐盐基因Hal1，并将它连接到pYES2表达载体上，测序表明其与已发表的序列比较，同源性99.3%，构建重组质粒pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为下一步利用该基因提高生物的耐盐水平提供了技术支持。
2 结果与分析
2.1 Hal1基因的PCR扩增
利用引物（P1，P2），以酿酒酵母基因组总DNA为模板，经PCR扩增得到了1条900bp左右的单一条带，与预期结果一致（见图1）。
2.2 Hal1基因的克隆
将上述PCR产物酶切回收与pYES2连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将随机挑取的菌落扩增后提取质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切鉴定，第3号克隆酶切后电泳得到约900bp大小的片断（见图2）。
2.3 重组质粒pYES2-Hal1序列测定
进而将3号克隆测序，结果显示，该核苷酸序列与Genbank数据库已报道的序列相比，同源性为99.3%（见图3）。
3 结论与讨论
酿酒酵母BWG1-7A具有较强的耐盐能力，可在含有7%NaCl的YPD培养基中生长。本试验通过PCR技术，成功地从其DNA中克隆到耐盐基因Hal1。测定的阳性克隆序列，与GenBank上公布的Hal1基因相比较，其核苷酸同源性为99.3%。与已发表的序列同源，将为Hal1基因植物表达载体的构建和转化提供有力保障。
酵母菌的遗传物质结构、基因表达和调控过程等都与高等生物具有一致性，因此已将其作为一种研究农作物耐盐机制的模式生物得到广泛应用[6]。本研究采用的酿酒酵母，是分离耐盐基因的有效模型，有助于高等植物耐盐分子机理的研究，推动抗渗透胁迫工程的发展。
盐碱地是巨大的潜在资源，绿化盐碱地是扩大耕地面积，进一步发展农业生产、改善生态环境的重要措施。利用基因工程手段培育能在盐碱地上种植的林木，是利用盐碱地的一条经济而有效的途径。酿酒酵母Hal1基因在盐胁迫下能与促进Na 外排的ENA1基因及其他转运系统协同作用保持细胞内低的Na /K 比，以减轻Na 毒害，因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力[3]。
4 参考文献
[1] 周和平，张立新，禹锋，等.我国盐碱地改良技术综述及展望[J].现代农业科技，2007（11）：159-164.
[2]V INOCUR B，ALTMAN A. Recent advances in engineering p lant tolerance to a biotic stress： achievements and lim-itations[J].Current Opinion in Biotech-nology，2005（16）：123-132.
[3] R GAXIOLA，IF DE LARRINOA，JM Villalba，et al.A novel and conserved salt-induced protein is an important determinant of salt tolerance in yeast[J].EMBO，1992，11（9）：3157-3164.
[4] MARQUEZ JA，SERRANO R.Multiple transduction pathways regulate the sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt stress in yeast[J]. FEBS letters，1996（382）：89-92.
[5] 亚当斯A，戈特施林D E，凯泽C A. 酵母遗传学方法实验指南[M].刘子铎，译.北京：科学出版社，1998.
[6] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al. T ransfer of the yeast salt to lerance gene HAL 1 to cucum isme cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Res，1997，6（1）：41-50.