【摘 要】
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目的 构建具有靶向去唾液酸糖蛋白受体、溶酶体逃逸、DNA结合的多功能融合蛋白,并对表达产物进行功能鉴定.方法 合成编码Melittin的两条寡核苷酸单链(GenBank:X02007),退火形
【机 构】
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解放军总医院肝胆外科医院全军肝胆外科研究所,华中科技大学同济医学院附属同济医院外科,中俄常州21世纪生物技术研究所
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目的 构建具有靶向去唾液酸糖蛋白受体、溶酶体逃逸、DNA结合的多功能融合蛋白,并对表达产物进行功能鉴定.方法 合成编码Melittin的两条寡核苷酸单链(GenBank:X02007),退火形成寡核苷酸双链；双酶切含抗去唾液酸糖蛋白单链抗体( ASGPR scFv) C1基因的载体C1/pIT2,0.7％低融点琼脂糖凝胶回收C1；以pSW50-Gal4为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增Gal4基因；采用分子克隆技术将其定向克隆至载体pGC4C26H中,获得重组质粒C1 MG/pGC4C26H；双酶切载体C1MG/pGG4C26H,胶回收片段C1MG定向克隆至载体pET-32c中,将含C1MG/pET-32c的BL21单菌落1∶100接种至1000 ml LB肉汤培养基中培养,并通过IPTG诱导表达.表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术( Western blot)和免疫组织化学分析重组蛋白C1 MG的抗原结合能力,溶血实验分析C1MG的生物学活性,肿瘤细胞生长抑制实验分析C1MG的DNA结合能力.结果 成功构建原核表达质粒C1MG/pET-32c,并经测序证实:在大肠杆菌BL21中有效表达重组融合蛋白C1MG；表达产物以包涵体形式存在；纯化的C1 MG大小为64.1 kDa,浓度为0.6g/L;Western blot结果说明C1MG能有效识别重组ASGPR,免疫组织化学结果证实C1 MG能结合到鼠肝细胞表面；溶血实验显示ClMG具有裂解红细胞膜功能；肿瘤细胞生长抑制实验证实C1 MG将pEBAF/tk-GAL4rec质粒有效地导入表达ASGPR的细胞中并表达TK基因,氯喹对肿瘤细胞生长抑制无明显影响.结论 在大肠杆菌中成功表达和纯化得到单链抗体-蜂毒肽-酵母转录因子(C1MG)的融合蛋白,该融合蛋白至少具有以下功能:ASGPR靶向识别能力、溶酶体膜裂解功能、以及DNA特异性结合功能,提示对肝癌的靶向治疗有潜在的应用价值.
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