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摘要[目的]研究沙田柚生长素响应基因SAUR基因编码的蛋白质序列所包含的生物信息学。[方法]以沙田柚自交和异交花柱为材料，通过高通量测序技术进行转录组测序，在差异表达基因中鉴定出SAUR基因。[结果]该基因全长857 bp（登录号为MH281940），开放阅读框（ORF）为381 bp，编码126个氨基酸，编码的蛋白质理论等电点为5.76，相对分子质量为13.74 kD，含有1个与Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守结构域。沙田柚SAUR基因在自交1～3 d花柱中的表达量（RPKM）分别为8.42、56.02、53.45；而在异交1～3 d花柱中的表达量分别为11.98、36.74、8.53。氨基酸序列分析表明，该基因编码的氨基酸与克莱门柚和甜橙SAUR基因编码的氨基酸的同源性分别为100%、99%。系统进化树显示，沙田柚SAUR基因与克莱门柚和甜橙的亲缘关系很近，属同一进化分支。[结论]研究结果可为今后深入研究沙田柚自交不亲和机理提供参考。
关键词 沙田柚；自交不亲和；SAUR基因；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0081-04
Abstract[Objective]To study the biological information contained in the protein sequence encoded small auxin up RNA（SAUR）gene.[Method]The selfpollinated and crosspollinated style of Citrus grandis var.Shatinyu Hort were used as test materials and transcriptome sequenced by highthroughput sequencing technology.The SAUR gene was identified in diferentially expressed genes.[Result]The gene was 857 bp（GenBank accession number：MH281940）in length with an open reading frame（ORF） of 381 bp，encoding 126 amino acids with theoretical pI value of 5.76，and deduced molecular weight of 13.74 kD，and contained a Auxin_inducible superfamily conserved domain.The expression（RPKM） of SAUR gene was 8.42，56.02 and 53.45 respectively in 1，2，3 days in selfpollinated styles，and the expression（RPKM） of the gene was 11.98，36.74 and 8.53 respectively in 1，2，3 days in crosspollinated styles.The homology analysis of amino acid sequence indicated that the SAUR protein shared 100% homology with Citrus clementina（XP_006452877.1）and 99% homology with Citrus sinensis（XP_006474595.1）.Phylogenetic analysis revealed that SAUR gene showed closer kinship with Citrus clementina and Citrus sinensis， indicating that they belong to the same evolutionary branch.[Conclution]The results could provide a theoretical reference for further study of selfincompatibility molecular mechanism in Citrus grandis var.Shatinyu Hort.
Key words Citrus grandis var.Shatinyu Hort；Selfincompatibility； SAUR gene；Sequence analysis
在配子體自交不亲和性（gametophytic selfincompatibility，GSI）植物中，花粉管生长在花柱中受到抑制，不能顺利完成受精作用[1]。研究发现，GSI受S位点的基因控制。在玄参科西班牙金鱼草S基因座中首次克隆到与花粉自交不亲和性决定因子相关的基因SLF（S-locus F-box）[2]；随后相继在茄科[3]、蔷薇科[4]等多个物种中发现自交不亲和相关的花柱不亲和因子S-RNase和花粉不亲和因子SLF/SFB（S-locus F-box /S-haplotype specific F-box）；罂粟属植物中的柱头S-因子PrsS具有抑制体外花粉管生长的作用[5]。同时，一些非S基因也参与植物自交不亲和过程，如抑制HT-B的表达会导致花柱丧失拒绝花粉的能力[6-7]。另外，一些信号分子如Ga2+、肌动蛋白以及蛋白激酶p56会影响花粉管的生长[8]。目前，沙田柚自交不亲和的研究已取得一定的进展。薛妙男等[9-10]确定了沙田柚自交中花粉管在花柱中停止生长的位置以及花柱通道细胞中的特异蛋白的产生部位和分布；秦新民等[11-13]分离和鉴定了沙田柚花粉管特异蛋白，同时，花粉管中特异蛋白的产生部位和分布也得到了确定。 SAURs（small auxin up RNAs）基因属生长素早期响应家族基因三大基因[14]。1987年，首个SAUR基因在大豆下胚轴中被发现[15]。大部分SAUR家族的基因都没有内含子，含有1个或多个生长素反应元件AuxREs[14]。SAUR基因含有1个下游元件DST，它会导致其编码的mRNAs极不稳定，易在短时间内被降解[16]。SAUR基因具有1个Auxin-inducible结构域，参与植物的生长素调节活动。研究发现，拟南芥AtSAUR通过调节细胞膨胀来调控下胚轴的生长[17]；OsSAUR54基因在水稻的柱头中特异表达，可能对花粉管的伸长有促进作用[18]。此外，拟南芥AtSAUR50基因参与光信号介导的花序梗发育[19]。
沙田柚（Citrus grandis var.Shatinyu Hort）是配子体高度不亲和果树。目前，有关SAUR基因参与植物自交不亲和性的报道尚少。为进一步探讨沙田柚自交不亲和的机理，笔者在对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序的基础上，通过对差异基因的分析以及所测的Unigenes进行功能注释，获得了1个沙田柚SAUR基因；并对其编码的蛋白质理化特征以及该基因在沙田柚自交和异交花柱中的表达模式进行了分析，旨在为深入研究沙田柚自交不亲和性的分子机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 材料采自广西灵川县潮田乡大山口村果园十年生沙田柚果树。分别收集人工授粉（沙田柚×沙田柚）和异交授粉（沙田柚×酸柚）1～3 d的花柱以及当天未开花的花柱，将其立即放入液氮中速冻处理，然后保存在-80 ℃超低温冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取、建库和测序。
总RNA提取采用改良的Trizol法[20]进行，RNA检测合格后交由深圳华大基因科技服务有限公司建库和测序，建库和测序的方法参考文献[21]的方法进行。
1.2.2 基因序列分析和系统树构建。
通过NCBI ORF Finder、DNAman、Conserved Domain Search、TMHMM、NetPhos3.1、SWISS-MODEL等软件对SAUR基因进行序列和理化性质分析。基于氨基酸序列SAUR基因的系统树用DNAman软件进行构建。
2 结果与分析
2.1 开放阅读框预测
沙田柚SAUR基因（Unigene8616_All）序列全长为857 bp（GenBank登录号为MH281940），通过NCBI ORF Finder和生物信息学软件DNAman进行分析，该序列的开放阅读框为381 bp，编码126个氨基酸（图1）。
2.2 功能结构域分析
将编码的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析，结果表明，该基因转录的蛋白质具有1个与Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守结构域（图2）。
2.3 表达模式分析
SAUR基因在沙田柚未授粉、自交和异交花柱中差异表达较为明显：在未授粉花柱中其表达量（RPKM）为5.10，自交（ZJ）1、2、3 d花柱中的表达量分别是8.42、56.02、53.45，其表达量在自交2 d中迅速上升，并维持在较高水平。而在异交（YJ）1、2、3 d花柱中的表达量分别是11.98、36.74、8.53，其表達量在异交2 d中上升后则迅速下降。利用RPKM对该基因在自交和异交花柱中的表达水平估算，设定FDRS≤0.001且差异倍数≥2倍的基因为显著差异表达基因，以RPKM值取2的对数值[log2（RPKM）]对ZJ1/YJ1（8.42/11.98），ZJ2/YJ2（56.02/36.74），ZJ3/YJ3（53.45/8.53）花柱中SAUR基因的表达水平进行统计分析，其log2（RPKM ratio）分别为-0.51、0.61和2.65。此外，在沙田柚自交和异交1～3 d的花柱中，该基因的表达量均明显高于未授粉花柱。
2.4 编码蛋白质的分析和疏水性预测
通过DNAman软件和在线软件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，该基因编码的蛋白质分子式为C599H946N166O190S7，等电点pI为5.76，分子质量为13.74 kD，不稳定系数为59.75（>40），属于不稳定蛋白。其中，该蛋白质携带的负电荷氨基酸（Asp + Glu）总数为17，正电荷氨基酸（Arg + Lys）总数为14。该基因编码的肽链中疏水性最大值约为2.33，位于第97位氨基酸，最小值约为-3.25，位于第62位氨基酸，该蛋白质疏水性平均值为-0.30，鉴定该蛋白质为亲水性蛋白，其疏水性分析结果见图3。
2.5 跨膜预测
运用跨膜蛋白数据库 TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对SAUR基因编码的蛋白进行跨膜区域预测，结果表明该蛋白不属于跨膜蛋白。
2.6 蛋白质的二级结构和三级结构预测
通过在线软件SOPMA分析该蛋白质的二级结构，该蛋白的α-螺旋占39.68%、延伸链占19.05%、无规则卷曲占41.27%（图4）。
运用在线软件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测该蛋白的三级结构，该蛋白三级结构包含了2个α-螺旋，由无规则卷曲连接（图5）。
2.7 蛋白质的磷酸化位点预测
通过在线软件NetPhos 3.1 Server对沙田柚SAUR基因编码蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明该基因编码的蛋白质可能的磷酸化位点共有10个（Ser），分别位于肽链的12、19、30、50、61、69、84、85、88、116位。 2.8 同源性分析
将沙田柚SAUR基因编码的氨基酸序列与GenBank数据库中下载的其他11种植物SAUR基因编码的氨基酸序列进行比对，结果表明，沙田柚SAUR基因编码的氨基酸与克莱门柚（Citrus clementina， XP_006452877.1）和甜橙（Citrus sinensis，XP_006474595.1）SAUR基因编码的氨基酸序列的同源性分别为100%和99%。利用DNAman软件构建系统发育树，结果表明沙田柚SAUR基因编码的蛋白质与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近，属于同一进化分支（图6）。
3 结论与讨论
SAUR基因家族是生长素响应因子中最大的一个家族，为植物所特有，在植物的免疫应发、胁迫应答、转录和转录调控等过程中发挥重要的作用[22]。目前，多种植物的SAUR基因已被克隆[17]，但鲜见关于沙田柚SAUR基因克隆的报道。该研究的Unigene8616_All序列与克莱门柚和甜橙的SAUR基因的同源性分别为100%和99%，同时含有1个Auxin_inducible保守结构域，说明Unigene8616_All序列是1个SAUR基因。
沙田柚SAUR基因在自交1～3 d花柱中的表达量（RPKM）分别为8.42、56.02、53.45；而在异交1～3 d花柱中的表达量分别为11.98、36.74、8.53。
陈腾土等[23]发现，沙田柚授粉3 d花柱的蛋白提取液有明显抑制自交花粉管生长的作用。研究发现，在体外SAUR蛋白能够与钙调蛋白结合，说明SAUR蛋白可能作为第二信使传导钙/钙调蛋白和生长素信号之间的联系，生长素作用之后SAUR基因编码的转录产物能够迅速积累[24-26]。沙田柚自交花柱中SAUR的表达量在授粉第2、3天明显高于异交花柱，推测在沙田柚自交过程中SAUR基因被激活后迅速上调表达，SAUR蛋白与钙/钙调蛋白结合，产生级联反应，参与自交不亲和过程。但SAUR基因与沙田柚自交不亲和性的分子机理尚有待进一步研究。
参考文献
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关键词 沙田柚；自交不亲和；SAUR基因；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0081-04
Abstract[Objective]To study the biological information contained in the protein sequence encoded small auxin up RNA（SAUR）gene.[Method]The selfpollinated and crosspollinated style of Citrus grandis var.Shatinyu Hort were used as test materials and transcriptome sequenced by highthroughput sequencing technology.The SAUR gene was identified in diferentially expressed genes.[Result]The gene was 857 bp（GenBank accession number：MH281940）in length with an open reading frame（ORF） of 381 bp，encoding 126 amino acids with theoretical pI value of 5.76，and deduced molecular weight of 13.74 kD，and contained a Auxin_inducible superfamily conserved domain.The expression（RPKM） of SAUR gene was 8.42，56.02 and 53.45 respectively in 1，2，3 days in selfpollinated styles，and the expression（RPKM） of the gene was 11.98，36.74 and 8.53 respectively in 1，2，3 days in crosspollinated styles.The homology analysis of amino acid sequence indicated that the SAUR protein shared 100% homology with Citrus clementina（XP_006452877.1）and 99% homology with Citrus sinensis（XP_006474595.1）.Phylogenetic analysis revealed that SAUR gene showed closer kinship with Citrus clementina and Citrus sinensis， indicating that they belong to the same evolutionary branch.[Conclution]The results could provide a theoretical reference for further study of selfincompatibility molecular mechanism in Citrus grandis var.Shatinyu Hort.
Key words Citrus grandis var.Shatinyu Hort；Selfincompatibility； SAUR gene；Sequence analysis
在配子體自交不亲和性（gametophytic selfincompatibility，GSI）植物中，花粉管生长在花柱中受到抑制，不能顺利完成受精作用[1]。研究发现，GSI受S位点的基因控制。在玄参科西班牙金鱼草S基因座中首次克隆到与花粉自交不亲和性决定因子相关的基因SLF（S-locus F-box）[2]；随后相继在茄科[3]、蔷薇科[4]等多个物种中发现自交不亲和相关的花柱不亲和因子S-RNase和花粉不亲和因子SLF/SFB（S-locus F-box /S-haplotype specific F-box）；罂粟属植物中的柱头S-因子PrsS具有抑制体外花粉管生长的作用[5]。同时，一些非S基因也参与植物自交不亲和过程，如抑制HT-B的表达会导致花柱丧失拒绝花粉的能力[6-7]。另外，一些信号分子如Ga2+、肌动蛋白以及蛋白激酶p56会影响花粉管的生长[8]。目前，沙田柚自交不亲和的研究已取得一定的进展。薛妙男等[9-10]确定了沙田柚自交中花粉管在花柱中停止生长的位置以及花柱通道细胞中的特异蛋白的产生部位和分布；秦新民等[11-13]分离和鉴定了沙田柚花粉管特异蛋白，同时，花粉管中特异蛋白的产生部位和分布也得到了确定。 SAURs（small auxin up RNAs）基因属生长素早期响应家族基因三大基因[14]。1987年，首个SAUR基因在大豆下胚轴中被发现[15]。大部分SAUR家族的基因都没有内含子，含有1个或多个生长素反应元件AuxREs[14]。SAUR基因含有1个下游元件DST，它会导致其编码的mRNAs极不稳定，易在短时间内被降解[16]。SAUR基因具有1个Auxin-inducible结构域，参与植物的生长素调节活动。研究发现，拟南芥AtSAUR通过调节细胞膨胀来调控下胚轴的生长[17]；OsSAUR54基因在水稻的柱头中特异表达，可能对花粉管的伸长有促进作用[18]。此外，拟南芥AtSAUR50基因参与光信号介导的花序梗发育[19]。
沙田柚（Citrus grandis var.Shatinyu Hort）是配子体高度不亲和果树。目前，有关SAUR基因参与植物自交不亲和性的报道尚少。为进一步探讨沙田柚自交不亲和的机理，笔者在对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序的基础上，通过对差异基因的分析以及所测的Unigenes进行功能注释，获得了1个沙田柚SAUR基因；并对其编码的蛋白质理化特征以及该基因在沙田柚自交和异交花柱中的表达模式进行了分析，旨在为深入研究沙田柚自交不亲和性的分子机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 材料采自广西灵川县潮田乡大山口村果园十年生沙田柚果树。分别收集人工授粉（沙田柚×沙田柚）和异交授粉（沙田柚×酸柚）1～3 d的花柱以及当天未开花的花柱，将其立即放入液氮中速冻处理，然后保存在-80 ℃超低温冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取、建库和测序。
总RNA提取采用改良的Trizol法[20]进行，RNA检测合格后交由深圳华大基因科技服务有限公司建库和测序，建库和测序的方法参考文献[21]的方法进行。
1.2.2 基因序列分析和系统树构建。
通过NCBI ORF Finder、DNAman、Conserved Domain Search、TMHMM、NetPhos3.1、SWISS-MODEL等软件对SAUR基因进行序列和理化性质分析。基于氨基酸序列SAUR基因的系统树用DNAman软件进行构建。
2 结果与分析
2.1 开放阅读框预测
沙田柚SAUR基因（Unigene8616_All）序列全长为857 bp（GenBank登录号为MH281940），通过NCBI ORF Finder和生物信息学软件DNAman进行分析，该序列的开放阅读框为381 bp，编码126个氨基酸（图1）。
2.2 功能结构域分析
将编码的氨基酸序列用NCBI上的Conserved Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析，结果表明，该基因转录的蛋白质具有1个与Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守结构域（图2）。
2.3 表达模式分析
SAUR基因在沙田柚未授粉、自交和异交花柱中差异表达较为明显：在未授粉花柱中其表达量（RPKM）为5.10，自交（ZJ）1、2、3 d花柱中的表达量分别是8.42、56.02、53.45，其表达量在自交2 d中迅速上升，并维持在较高水平。而在异交（YJ）1、2、3 d花柱中的表达量分别是11.98、36.74、8.53，其表達量在异交2 d中上升后则迅速下降。利用RPKM对该基因在自交和异交花柱中的表达水平估算，设定FDRS≤0.001且差异倍数≥2倍的基因为显著差异表达基因，以RPKM值取2的对数值[log2（RPKM）]对ZJ1/YJ1（8.42/11.98），ZJ2/YJ2（56.02/36.74），ZJ3/YJ3（53.45/8.53）花柱中SAUR基因的表达水平进行统计分析，其log2（RPKM ratio）分别为-0.51、0.61和2.65。此外，在沙田柚自交和异交1～3 d的花柱中，该基因的表达量均明显高于未授粉花柱。
2.4 编码蛋白质的分析和疏水性预测
通过DNAman软件和在线软件（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，该基因编码的蛋白质分子式为C599H946N166O190S7，等电点pI为5.76，分子质量为13.74 kD，不稳定系数为59.75（>40），属于不稳定蛋白。其中，该蛋白质携带的负电荷氨基酸（Asp + Glu）总数为17，正电荷氨基酸（Arg + Lys）总数为14。该基因编码的肽链中疏水性最大值约为2.33，位于第97位氨基酸，最小值约为-3.25，位于第62位氨基酸，该蛋白质疏水性平均值为-0.30，鉴定该蛋白质为亲水性蛋白，其疏水性分析结果见图3。
2.5 跨膜预测
运用跨膜蛋白数据库 TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对SAUR基因编码的蛋白进行跨膜区域预测，结果表明该蛋白不属于跨膜蛋白。
2.6 蛋白质的二级结构和三级结构预测
通过在线软件SOPMA分析该蛋白质的二级结构，该蛋白的α-螺旋占39.68%、延伸链占19.05%、无规则卷曲占41.27%（图4）。
运用在线软件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测该蛋白的三级结构，该蛋白三级结构包含了2个α-螺旋，由无规则卷曲连接（图5）。
2.7 蛋白质的磷酸化位点预测
通过在线软件NetPhos 3.1 Server对沙田柚SAUR基因编码蛋白进行磷酸化位点预测，结果表明该基因编码的蛋白质可能的磷酸化位点共有10个（Ser），分别位于肽链的12、19、30、50、61、69、84、85、88、116位。 2.8 同源性分析
将沙田柚SAUR基因编码的氨基酸序列与GenBank数据库中下载的其他11种植物SAUR基因编码的氨基酸序列进行比对，结果表明，沙田柚SAUR基因编码的氨基酸与克莱门柚（Citrus clementina， XP_006452877.1）和甜橙（Citrus sinensis，XP_006474595.1）SAUR基因编码的氨基酸序列的同源性分别为100%和99%。利用DNAman软件构建系统发育树，结果表明沙田柚SAUR基因编码的蛋白质与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近，属于同一进化分支（图6）。
3 结论与讨论
SAUR基因家族是生长素响应因子中最大的一个家族，为植物所特有，在植物的免疫应发、胁迫应答、转录和转录调控等过程中发挥重要的作用[22]。目前，多种植物的SAUR基因已被克隆[17]，但鲜见关于沙田柚SAUR基因克隆的报道。该研究的Unigene8616_All序列与克莱门柚和甜橙的SAUR基因的同源性分别为100%和99%，同时含有1个Auxin_inducible保守结构域，说明Unigene8616_All序列是1个SAUR基因。
沙田柚SAUR基因在自交1～3 d花柱中的表达量（RPKM）分别为8.42、56.02、53.45；而在异交1～3 d花柱中的表达量分别为11.98、36.74、8.53。
陈腾土等[23]发现，沙田柚授粉3 d花柱的蛋白提取液有明显抑制自交花粉管生长的作用。研究发现，在体外SAUR蛋白能够与钙调蛋白结合，说明SAUR蛋白可能作为第二信使传导钙/钙调蛋白和生长素信号之间的联系，生长素作用之后SAUR基因编码的转录产物能够迅速积累[24-26]。沙田柚自交花柱中SAUR的表达量在授粉第2、3天明显高于异交花柱，推测在沙田柚自交过程中SAUR基因被激活后迅速上调表达，SAUR蛋白与钙/钙调蛋白结合，产生级联反应，参与自交不亲和过程。但SAUR基因与沙田柚自交不亲和性的分子机理尚有待进一步研究。
参考文献
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