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摘 要：剩余污泥中蛋白質的资源化利用是目前研究的热点，污泥预处理则是实现污泥中蛋白质释放的重要途径。为了进一步提高剩余污泥中蛋白质的溶出效果，选取热碱预处理、超声碱联合预处理、溶菌酶预处理对污泥进行溶胞，以蛋白质提取浓度为主要指标进行参数优化，并利用等电点法对粗提取蛋白进行纯化回收。结果表明：溶胞效果热碱预处理（pH值13、温度140 ℃、时间1.5 h，2 062.98 mg/L）>超声碱联合预处理（497.76 mg/L）>溶菌酶预处理（269.95 mg/L），且在pH值为3时热碱预处理蛋白质纯化回收率可达62.42 %。试验结果表明：热碱预处理在提取效果方面较另外两种方法优势明显，具有良好的利用前景。
关键词：剩余污泥;热碱预处理;超声碱联合预处理;溶菌酶预处理;蛋白质
中图分类号：X703 文献标志码：A 文章编号：2096-6717（2020）04-0132-09
收稿日期：2020-11-11
基金项目：国家自然科学基金（No. 51608241）
作者简介：潘倩（1996- ），女，主要从事剩余污泥的资源化利用研究，E-mail：547078323@qq.com。
杨本芹（通信作者），女，博士，副教授，E-mail：ynybq87@kust.edu.cn。
Received：2020-11-11
Foundation items：National Natural Science Foundation of China （No. 51608241）
Author brief：PAN Qian （1996- ）， main research interest： resource utilization of residual sludge， E-mail： 547078323@qq.com.
YANG Benqin （corresponding author）， PhD， associate professor， E-mail： ynybq87@kust.edu.cn.
Optimal research on methods to extract protein from residual sludge of recycling
PAN Qian， LIU Yanmei， ZHOU Xiandong， PAN Xuejun， YANG Benqin
（Faculty of Environmental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， P. R. China）
Abstract： The resource utilization of protein in excess sludge is a research hotspot at home and abroad， and sludge pretreatment is an important way to realize protein release from sludge. In order to further improve the dissolution efficiency of protein in excess sludge， this paper selected thermal-alkali pretreatment， ultrasonic-alkali pretreatment and lysozyme pretreatment as the method of disintegration in sludge， and optimized the parameters with the protein extraction concentration as the main index. The isoelectric point method was also used to purify and recover crude protein. The results showed that the cellulolytic effect： thermal-alkali pretreatment （pH 13， temperature 140 ℃， time 1.5 h， 2 062.98 mg/L） > ultrasonic-alkali pretreatment （497.76 mg/L） > lysozyme pretreatment （269.95 mg/L）， and the protein purification recovery of thermal-alkali pretreatment at pH 3 can reach 62.42%. It can be seen from the above test results that the thermal-alkali pretreatment has obvious advantages over the other two methods in terms of extraction effect， deserving of exploitation and utilization.
Keywords：excess sludge; thermal-alkali pretreatment; ultrasound-alkali pretreatment; lysozyme pretreatment; protein 剩余污泥是指污水处理厂在对污水进行生化处理时产生的不同废弃物的混合物。近年来，随着污水处理量的不断增多，剩余污泥的产量也逐年上升，预计2020年—2025年间，污泥的年产量有望突破6 000万t（以含水率80%计算）[1]。研究表明，剩余污泥的处理处置费用高达整个污水厂总运行费用的65%[2]，超过80%的污泥因处理不当成为环境的二次污染源[3]。因此，将污泥进行有效处理，以减少其对环境的污染是目前水处理行业发展的重中之重。
剩余污泥中含有大量蛋白质（约占污泥总量的30%～60%），充分利用其中的蛋白质，一方面可以达到污泥资源化的目的，另一方面还能减轻剩余污泥对环境的危害[4]。蛋白质资源化途径包括动物饲料、木材粘合剂、泡沫灭火剂以及混凝土发泡剂等。Hwang等[5]发现，在污泥中提取出来的蛋白质重金属含量低于法定标准，检测结果中也不含黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和沙门氏菌D组等有毒有害物质，且对其进行白鼠试验无明显影响，证实其应用于动物饲料具有可行性。Pervaiz等[6]发现，从污泥中回收的蛋白质较未处理的污泥抗剪强度有很大提升，有作为木材粘合剂的巨大潜能。Li等[7]发现，对啤酒厂污泥进行处理后，其中提取出的蛋白质可作为复合蛋白发泡剂使用。由此可见，剩余污泥中提取回收的蛋白质有很大的利用空间。
截至目前，剩余污泥中蛋白质的提取技术还未得到广泛应用，其原因主要是效率低、不经济。污泥预处理是目前使用最多的提高蛋白质溶出效率的方法，其中主要包含热预处理[8]、碱预处理[9]、臭氧预处理[10]、超声预处理[11]、酶预处理[12]以及其中几种处理方式形成的联合预处理。在单独预处理方式中，不同的预处理方式都存在其相应的缺点，例如，热预处理能耗较高，碱预处理对仪器腐蚀较大，臭氧预处理适用范围过窄，超声预处理难以应用到实际工程中等[13]。联合预处理是基于不同预处理方式的作用条件，充分考虑其协同作用，进一步提高污泥细胞的溶解效率的一种高效预处理方法。目前，大部分研究者对单独的预处理提取蛋白质进行了许多条件优化，但很少有对不同预处理方法进行比较并对所提取的蛋白质进行纯化回收的研究。
笔者采用热碱联合预处理[14]、超声碱联合预处理[15]和溶菌酶预处理[16]3种预处理方法，通过对溶出蛋白质浓度进行分析，探究其发挥破胞作用的最优条件，并分别比较3种方法提取蛋白质的效果，最后优化等电点法，确定回收纯化蛋白质的最佳pH值，旨在为污泥中蛋白质的提取利用提供相应参考。
1 材料与方法
剩余污泥取自昆明市污水厂的污泥浓缩池，该厂内采用A2/O（Anaerobic-Anoxic-Oxic）工艺进行污水生物处理。剩余污泥主要理化性质如表1所示。
试验以蛋白质浓度为主要指标来确定各项预处理方法的最优破胞条件。原始污泥总蛋白浓度使用凯氏定氮法[17]测定，离心后的上清液中蛋白质采用BCA蛋白质试剂盒[18]结合酶标仪（MultiskanTM FC，赛默飞世尔科技）测定。
凯氏定氮法蛋白质计算见式（1）。
X=（V1-V2）×c×0.014m×V3/100×F×100（1）
式中：X为蛋白质含量，g/（100 g）;V1为试液消耗盐酸标准滴定液的体积，mL;V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL;c为盐酸标准滴定液的浓度，mol/L;m为试样的质量，g;V3为吸取消化液的体积，mL;F为氮换算为蛋白质的系数，取6.25。
2 试验设计
将污水厂所取剩余污泥浓度调至约20 000 mg/L，然后分别进行试验。
2.1 热碱破解剩余污泥试验
热碱破解污泥试验主要从pH值、温度、时间3个影响因素来考察污泥溶胞效果，设置如下单因素试验：
1）pH优化试验。 参照崔静等[19]和翟世民等[20]的研究，在破胞温度为140 ℃、时间为2 h的条件下，在5个烧杯中分别取100 mL的剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液将pH值分别调至9、10、11、12和13后在恒温箱（XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司）中进行溶胞，优化出最优pH值。
2）温度优化试验。 在6个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，恒温箱温度分别调节为100、120、140、160、180、200 ℃，在优化得到的最优pH值条件下破胞2 h，得到最优温度。
3）时间优化试验。 在6个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，在得到的最优pH值和温度下，分别破胞0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，若此步优化得出的试验结果与前两步优化时所用时间不一致，则用该步骤得到的最优时间重复前两个步骤，得出最终试验结果。
2.2 超声碱联合破解污泥试验
超声联合碱破解污泥试验主要从pH值、超声功率、超声时间3个影响因素考察污泥破胞效果，设定如下单因素试验：
1）pH值优化试验。 参照康晓荣[21]的研究，在溶胞功率为3 W/mL（超声期间超声3 s停1 s）、时间为30 min的条件下，在5个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液调节pH值，依次為9、10、11、12和13，进行破胞，优化出最优pH值。
2）功率优化试验。 在6个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，在最优pH值条件下调节超声功率，依次为1、2、3、4、5、6 W/mL，破胞30 min，优化出最优功率。
3）时间优化试验。 在5个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，在得到的最优pH值和超声功率条件下依次破胞10、20、30、40、50 min，若此步优化得出的试验结果与前两步优化时所用时间不一致，则用该步骤得到的最优时间重复前两个步骤，得出最终试验结果。 2.3 溶菌酶破解污泥试验
溶菌酶（溶菌酶冻干粉，北京索莱宝科技有限公司）破解试验主要从pH值、酶浓度、处理时间3个影响因素来考察污泥的破胞效果，设定如下单因素试验：
1）pH值优化试验。 溶菌酶试验参照陆钧皓[22]的研究，在12个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，其中6个保持酶浓度在200 mg/g，依次调节pH值为4、5、6、7、8、9，于室温下破胞4 h;另外6个在不加酶的情况下，依次调节pH值为4、5、6、7、8、9，于室温下破胞4 h;依据两者差值即可分析酶单独作用时的最优pH值。
2）酶浓度优化试验。 在7个烧杯中分别取100 mL等浓度的剩余污泥，依次调节烧杯酶浓度为60、90、120、150、200、250、280 mg/g，在确定的最优pH值和室温下破胞4 h，优化出最优酶浓度。
3）时间优化试验。 在7个烧杯中分别取100 mL等浓度的剩余污泥，调节酶浓度及pH值为确定的最优值，室温下依次反应2、3、4、5、6、7、8 h，若此步优化得出的试验结果与前两步优化时所用时间不一致，则用该步骤得到的最优时间重复前两个步骤，得出最终试验结果。
经以上每种因素预处理后的污泥溶液均在8 000 rpm高速冷冻离心机上离心20 min，离心后上清液过0.45 μm滤膜，取滤液进行蛋白质的浓度测定，以得到高效经济的预处理方法及其最优作用条件。
2.4 溶菌酶對提取后蛋白质的影响
以热碱预处理为例，测定热碱预处理后的蛋白质溶液，得到蛋白质浓度值P1。再分别称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的溶菌酶冻干粉加入100 mL水中，得到6种不同浓度的溶菌酶溶液，测定蛋白质浓度依次为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6。取预处理后的蛋白质溶液，分别与6种配制溶菌酶溶液各5 mL进行混合，得到10 mL不同浓度蛋白质混合液，测定蛋白质浓度依次为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。最后检验等式（2）是否成立，以探究溶菌酶对提取后蛋白质浓度的影响。
P1×5+Qx×510=Zx（2）
式中，x的取值范围为1～6。
2.5 等电点回收蛋白质试验条件优化
将试验得到的上清液称为蛋白溶液。在6个烧杯中分别取100 mL 蛋白溶液，利用2 mol/L的硫酸溶液调节其pH值，依次为1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5，然后于-4 ℃冰箱静置1.5 h，将静置后的蛋白溶液于8 000 rpm下离心20 min，得到的上清液过0.45 μm滤膜，取部分滤液分别进行蛋白质浓度测定，剩下的滤液再分别通过纤维素透析袋（截留分子量20 000 Da）纯化备用。
3 结果与讨论
3.1 热碱预处理参数的确定
如图1（a）所示，随着pH值的升高，溶液中蛋白质浓度逐渐升高，在pH为12～13区间显著增加。当pH=13时，溶液中蛋白质浓度达到最大值2 515.55 mg/L（考虑到碱性过高对污泥处理实际意义不大，较高pH值会使污泥产生大量褐变反应[23]，使其中小分子发生聚集，预处理效果反而会降低，故将pH=13设为最大值）。这说明当pH<12时，污泥细胞的溶解程度不高，当pH>12时，污泥溶胞率明显上升。在高温的协助作用下，强碱可以与细胞中的脂类物质发生皂化反应[24]，加速破坏污泥中的细胞结构。除此之外，强碱具有化学和电离的双重作用，更容易使污泥中的微生物细胞发生溶解，进而使胞内物质溶出[25]，故选取pH值为13为最佳碱强度。
如图1（b）所示，热碱处理中蛋白质浓度随着温度的升高而逐渐升高，在140 ℃时达到最大值1 810.87 mg/L，当温度超过140 ℃后，蛋白质浓度呈下降趋势。热碱处理过程中，随着温度的升高，污泥中的微生物絮体结构开始分散，细胞壁和细胞质也在高温的作用下溶解，导致细胞内大量有机物溶出。大分子蛋白质也在高温作用下变成小分子蛋白质，使溶液中蛋白质浓度逐渐升高[26]。与此同时，在碱性条件下，过高的温度会使蛋白质水解为氨基酸，β-氨基酸是其主要成分，而β-氨基酸在高温条件下会发生脱氨反应，生成氨气和不饱和羧酸盐，在强碱条件下，氨气会从溶液中溢出故溶液中溶解性蛋白质的浓度会降低[27]。
图1（c）所示为热碱预处理时间对蛋白质浓度的影响，热碱处理前期，溶液中蛋白质浓度随时间逐渐增加，在处理时间为1.5 h时达到最大值2 068.46 mg/L，后期随着时间的增加，蛋白质浓度缓慢下降。这是因为在热碱反应中胞内物质的释放和蛋白质的水解是同时进行的，在前1.5 h，参照Fan等[28]的试验结论，因为细胞内物质释放速率大于蛋白质的碱性水解作用，故蛋白质浓度呈现上升趋势，1.5 h后，蛋白质的水解速率大于胞内蛋白质溶出速率，故蛋白质浓度呈现下降趋势。Li等[29]的研究结果表明，碱破解污泥细胞的过程分为快速和慢速阶段，大部分的胞内有机物质会在前30 min被释放出来，因此，考虑到经济和溶胞效果，选取1.5 h为最佳预处理时间。
以上3个单因素试验结果确定了热碱处理的最优条件为：pH值13、时间1.5 h、温度140 ℃，与预设条件存在相应误差，可能是因为污泥性质和试验条件的差异。考虑到试验误差情况，取三者蛋白质最大浓度的平均值，即热碱预处理在最佳条件下可使溶液中蛋白质浓度达到2 062.98 mg/L。
3.2 超声碱联合预处理参数的确定
由图2（a）可知，在超声联合碱预处理污泥时，碱的强度至关重要。当pH<12时，随着碱强度的增加，溶液中蛋白质浓度不断增加，在pH值为12时达到最大值488.73 mg/L，当pH>12时，蛋白质浓度开始下降。因为超声波具有破坏污泥絮体结构的作用，当声波能量达到一定值时，污泥絮体结构分散，加大污泥颗粒与碱的接触面积，提高碱对细胞壁的破坏作用，碱性越强对污泥的溶胞效果越明显[30]。但在超声作用下，碱性过强会加快溶液中部分有机物的分解，进而导致溶液中蛋白质含量降低。 图2（b）显示，在预处理时间为30 min、pH值为12的条件下，当功率为1 W/mL时，蛋白质浓度达到388.35 mg/L，当功率继续增加至4 W/mL时，蛋白质浓度逐渐降低，但当功率为5 W/mL时，蛋白质浓度迅速增加至最大值497.89 mg/L，后期随着功率的增加，蛋白质浓度再次呈下降趋势。超声波在联合碱预处理时，主要凭借其空化作用[31]（通过剪切液体形成空化核）和声化学作用[32]（通过超声波加速反应的进行或产生新的化学物质）达到溶胞的目的。在功率由1 W/mL增加到4 W/mL的阶段，蛋白质浓度降低的原因可能是污泥絮体粒径过大，碱未能很好地发挥作用，超声功率的增加反而加快了蛋白质的水解速率。超声与碱联合作用时存在最适功率和最佳粒径的说法[33]，只有污泥经过一定功率的超声后，在剪切作用下分散成最佳粒径大小，这时碱才能发挥其最大破坏作用使细胞内容物流出。试验证明了5 W/mL为该试验条件下的最优功率。
如图2（c）所示，当时间小于30 min时，蛋白质浓度随着时间的增加呈现上升趋势，30 min时达到499.48 mg/L，30 min以后蛋白质浓度趋于平稳。在试验前期，超声波和碱同时起作用，加速了污泥絮体结构的分解和细胞壁的破碎，促使蛋白质浓度不断增加。但反应持续一段时间后，一方面由于碱的消耗导致碱性下降，未能起到跟初期相同的碱解作用，另一方面超声波单独作用时破解细胞需要的能量更大，随着碱解作用的降低，單独的超声作用只能破坏很小一部分污泥细胞，导致后期蛋白质浓度不再有明显增加[34]。
试验结果确定了超声联合碱预处理的最佳条件为：pH值12、功率5 W/mL、时间30 min。相同地，考虑到试验误差取三者蛋白质最大浓度的平均值，即在超声联合碱预处理的最优作用条件下可使溶液中蛋白质浓度达到497.76 mg/L。
3.3 溶菌酶预处理参数的确定
在酶浓度为200 mg/g、时间为6 h的条件下，在pH值跨度4～9的条件下试验研究了pH值的单独作用效果，同时，以相同pH值跨度研究溶菌酶的作用效果，两者的差值即为溶菌酶单独作用时的效果。如图3（a）差值变化曲线所示，当pH值等于7时，酶单独起作用时溶液中蛋白质浓度达到241.06 mg/L，且高于其他任何pH值下的浓度。pH值是影响溶菌酶水解污泥的一个重要因素，过酸或过碱都会对酶发挥其最大活性产生影响。酶分子在不同的pH值溶液中具有不同解离状态，固定的某种解离状态只能与一种底物结合酶活性才能达到最高。除此之外，pH值也会影响酶分子中某些基团的解离，酶底物的专一性、酶分子活性中心的构象等都会影响这些基团的解离状态，进而影响酶的活性[35]。
如图3（b）所示，当酶浓度较低时，溶液中蛋白质浓度随着酶浓度的增高而增高，后期随着酶浓度的增高，蛋白质浓度增加趋势较为平缓。当溶菌酶浓度为200 mg/g时，溶液中蛋白质浓度达到最高值297.14 mg/L。这是因为随着前期酶浓度的增加，底物开始与酶接触反应，促使大量的有机物质由固相转移到液相中，使得溶液中蛋白质浓度逐渐升高。但当反应体系中所有底物与所投加溶菌酶充分接触后，底物几乎已全部与酶分子结合形成络合物[36]，故当酶量增加时，溶液中蛋白质浓度不再显著增加。
如图3（c）所示，当反应时间小于6 h时，随着反应时间的增加，溶液中蛋白质浓度逐渐增加，在6 h时达到271.65 mg/L，当反应时间大于6 h时，蛋白质浓度呈明显降低的趋势。反应时间是酶发挥活性的一个重要因素，只有当在酶与底物充分接触，充分反应之后，污泥才能最大程度地释放其内含物，进而使得溶液中蛋白质浓度上升。在反应的前6 h内，在外界振荡和恒温条件下，酶与剩余污泥不断反应，使得污泥被水解并释放出大量胞内物，导致溶液中蛋白质浓度上升，当大于6 h后，溶菌酶已与底物充分接触反应，此时蛋白质的水解速度大于其释放速度，进而溶液中蛋白质浓度呈下降趋势。
由以上3个因素影响试验确定溶菌酶预处理的最优条件为：pH值7、酶浓度200 mg/g，时间6 h，在最优作用条件下，可使溶液中蛋白质浓度达到269.95 mg/L。
通过对3种方法的结果对比，得出热碱法（2 062.98 mg/L）>超声联合碱法（497.76 mg/L）>溶菌酶法（269.95 mg/L），故选取热碱法进行下一步试验。
经过预处理后的蛋白质可能会发生部分变性，但不影响后期对提取蛋白质粘度特性[37]，故暂时不用考虑蛋白质变性对试验结果的影响。
3.4 溶菌酶对提取后蛋白质的影响结果
如图4所示，A、B、C、D、E、F分别代表提取蛋白质溶液分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL的溶菌酶溶液混合得到的蛋白质浓度理论值与实际值。由图4可以看出，理论值与实际值差距很小，几乎可以忽略，溶菌酶对提取蛋白质浓度几乎无影响。溶菌酶的作用机制主要是针对细胞壁上的肽聚糖，通过肽键上的活性部位水解切断N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，从而达到破坏细胞壁的作用，对蛋白质没有破坏作用，这与试验得出的结论一致[38]。
3.5 等电点回收蛋白质试验结果
图5显示了由热碱法提取的上清液采用等电点法回收蛋白质随pH值的影响，蛋白质回收率随pH值的增加呈先上升后下降的趋势，当pH值为3时，蛋白质的回收率达到最大值62.42%。蛋白质是由多种氨基酸连接而成的生物大分子，两性电解质，在偏酸和偏碱溶液中会分别带正电和负电。通过调节pH值的大小可破坏或削弱分子表面的水化膜和双电层，使分子间引力增加，进而降低蛋白质在溶液中的溶解度，变为沉淀析出[39]。Hwang等[5]发现，在pH值为3.3时城市污泥蛋白质回收率最高，其结论与本研究相符。
4 结论与展望 采用熱碱法、超声碱联合法、溶菌酶法分别对剩余污泥进行预处理，得出最优预处理条件，对比提取效率可看出：热碱法（pH值13、温度140 ℃、时间1.5 h，2 062.98 mg/L）>超声联合碱法（pH值12、功率5 W/mL、时间30 min，497.76 mg/L）>溶菌酶法（pH值7、酶浓度200 mg/g、时间6 h，269.95 mg/L），对热碱法提取的上清液采用等电点法回收蛋白质，在pH值为3时蛋白质的回收率最高，为62.42 %。
剩余污泥中的蛋白质具有较大的利用潜能，但目前蛋白质的提取方法仍存在能耗大、二次污染等问题，许多技术和应用环节还不够成熟，仍需要不断完善。因此，在剩余污泥蛋白质的提取及应用上还可开展大量的研究工作。参考文献：
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（编辑 章润红）
关键词：剩余污泥;热碱预处理;超声碱联合预处理;溶菌酶预处理;蛋白质
中图分类号：X703 文献标志码：A 文章编号：2096-6717（2020）04-0132-09
收稿日期：2020-11-11
基金项目：国家自然科学基金（No. 51608241）
作者简介：潘倩（1996- ），女，主要从事剩余污泥的资源化利用研究，E-mail：547078323@qq.com。
杨本芹（通信作者），女，博士，副教授，E-mail：ynybq87@kust.edu.cn。
Received：2020-11-11
Foundation items：National Natural Science Foundation of China （No. 51608241）
Author brief：PAN Qian （1996- ）， main research interest： resource utilization of residual sludge， E-mail： 547078323@qq.com.
YANG Benqin （corresponding author）， PhD， associate professor， E-mail： ynybq87@kust.edu.cn.
Optimal research on methods to extract protein from residual sludge of recycling
PAN Qian， LIU Yanmei， ZHOU Xiandong， PAN Xuejun， YANG Benqin
（Faculty of Environmental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， P. R. China）
Abstract： The resource utilization of protein in excess sludge is a research hotspot at home and abroad， and sludge pretreatment is an important way to realize protein release from sludge. In order to further improve the dissolution efficiency of protein in excess sludge， this paper selected thermal-alkali pretreatment， ultrasonic-alkali pretreatment and lysozyme pretreatment as the method of disintegration in sludge， and optimized the parameters with the protein extraction concentration as the main index. The isoelectric point method was also used to purify and recover crude protein. The results showed that the cellulolytic effect： thermal-alkali pretreatment （pH 13， temperature 140 ℃， time 1.5 h， 2 062.98 mg/L） > ultrasonic-alkali pretreatment （497.76 mg/L） > lysozyme pretreatment （269.95 mg/L）， and the protein purification recovery of thermal-alkali pretreatment at pH 3 can reach 62.42%. It can be seen from the above test results that the thermal-alkali pretreatment has obvious advantages over the other two methods in terms of extraction effect， deserving of exploitation and utilization.
Keywords：excess sludge; thermal-alkali pretreatment; ultrasound-alkali pretreatment; lysozyme pretreatment; protein 剩余污泥是指污水处理厂在对污水进行生化处理时产生的不同废弃物的混合物。近年来，随着污水处理量的不断增多，剩余污泥的产量也逐年上升，预计2020年—2025年间，污泥的年产量有望突破6 000万t（以含水率80%计算）[1]。研究表明，剩余污泥的处理处置费用高达整个污水厂总运行费用的65%[2]，超过80%的污泥因处理不当成为环境的二次污染源[3]。因此，将污泥进行有效处理，以减少其对环境的污染是目前水处理行业发展的重中之重。
剩余污泥中含有大量蛋白质（约占污泥总量的30%～60%），充分利用其中的蛋白质，一方面可以达到污泥资源化的目的，另一方面还能减轻剩余污泥对环境的危害[4]。蛋白质资源化途径包括动物饲料、木材粘合剂、泡沫灭火剂以及混凝土发泡剂等。Hwang等[5]发现，在污泥中提取出来的蛋白质重金属含量低于法定标准，检测结果中也不含黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和沙门氏菌D组等有毒有害物质，且对其进行白鼠试验无明显影响，证实其应用于动物饲料具有可行性。Pervaiz等[6]发现，从污泥中回收的蛋白质较未处理的污泥抗剪强度有很大提升，有作为木材粘合剂的巨大潜能。Li等[7]发现，对啤酒厂污泥进行处理后，其中提取出的蛋白质可作为复合蛋白发泡剂使用。由此可见，剩余污泥中提取回收的蛋白质有很大的利用空间。
截至目前，剩余污泥中蛋白质的提取技术还未得到广泛应用，其原因主要是效率低、不经济。污泥预处理是目前使用最多的提高蛋白质溶出效率的方法，其中主要包含热预处理[8]、碱预处理[9]、臭氧预处理[10]、超声预处理[11]、酶预处理[12]以及其中几种处理方式形成的联合预处理。在单独预处理方式中，不同的预处理方式都存在其相应的缺点，例如，热预处理能耗较高，碱预处理对仪器腐蚀较大，臭氧预处理适用范围过窄，超声预处理难以应用到实际工程中等[13]。联合预处理是基于不同预处理方式的作用条件，充分考虑其协同作用，进一步提高污泥细胞的溶解效率的一种高效预处理方法。目前，大部分研究者对单独的预处理提取蛋白质进行了许多条件优化，但很少有对不同预处理方法进行比较并对所提取的蛋白质进行纯化回收的研究。
笔者采用热碱联合预处理[14]、超声碱联合预处理[15]和溶菌酶预处理[16]3种预处理方法，通过对溶出蛋白质浓度进行分析，探究其发挥破胞作用的最优条件，并分别比较3种方法提取蛋白质的效果，最后优化等电点法，确定回收纯化蛋白质的最佳pH值，旨在为污泥中蛋白质的提取利用提供相应参考。
1 材料与方法
剩余污泥取自昆明市污水厂的污泥浓缩池，该厂内采用A2/O（Anaerobic-Anoxic-Oxic）工艺进行污水生物处理。剩余污泥主要理化性质如表1所示。
试验以蛋白质浓度为主要指标来确定各项预处理方法的最优破胞条件。原始污泥总蛋白浓度使用凯氏定氮法[17]测定，离心后的上清液中蛋白质采用BCA蛋白质试剂盒[18]结合酶标仪（MultiskanTM FC，赛默飞世尔科技）测定。
凯氏定氮法蛋白质计算见式（1）。
X=（V1-V2）×c×0.014m×V3/100×F×100（1）
式中：X为蛋白质含量，g/（100 g）;V1为试液消耗盐酸标准滴定液的体积，mL;V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL;c为盐酸标准滴定液的浓度，mol/L;m为试样的质量，g;V3为吸取消化液的体积，mL;F为氮换算为蛋白质的系数，取6.25。
2 试验设计
将污水厂所取剩余污泥浓度调至约20 000 mg/L，然后分别进行试验。
2.1 热碱破解剩余污泥试验
热碱破解污泥试验主要从pH值、温度、时间3个影响因素来考察污泥溶胞效果，设置如下单因素试验：
1）pH优化试验。 参照崔静等[19]和翟世民等[20]的研究，在破胞温度为140 ℃、时间为2 h的条件下，在5个烧杯中分别取100 mL的剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液将pH值分别调至9、10、11、12和13后在恒温箱（XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司）中进行溶胞，优化出最优pH值。
2）温度优化试验。 在6个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，恒温箱温度分别调节为100、120、140、160、180、200 ℃，在优化得到的最优pH值条件下破胞2 h，得到最优温度。
3）时间优化试验。 在6个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，在得到的最优pH值和温度下，分别破胞0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，若此步优化得出的试验结果与前两步优化时所用时间不一致，则用该步骤得到的最优时间重复前两个步骤，得出最终试验结果。
2.2 超声碱联合破解污泥试验
超声联合碱破解污泥试验主要从pH值、超声功率、超声时间3个影响因素考察污泥破胞效果，设定如下单因素试验：
1）pH值优化试验。 参照康晓荣[21]的研究，在溶胞功率为3 W/mL（超声期间超声3 s停1 s）、时间为30 min的条件下，在5个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液调节pH值，依次為9、10、11、12和13，进行破胞，优化出最优pH值。
2）功率优化试验。 在6个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，在最优pH值条件下调节超声功率，依次为1、2、3、4、5、6 W/mL，破胞30 min，优化出最优功率。
3）时间优化试验。 在5个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，在得到的最优pH值和超声功率条件下依次破胞10、20、30、40、50 min，若此步优化得出的试验结果与前两步优化时所用时间不一致，则用该步骤得到的最优时间重复前两个步骤，得出最终试验结果。 2.3 溶菌酶破解污泥试验
溶菌酶（溶菌酶冻干粉，北京索莱宝科技有限公司）破解试验主要从pH值、酶浓度、处理时间3个影响因素来考察污泥的破胞效果，设定如下单因素试验：
1）pH值优化试验。 溶菌酶试验参照陆钧皓[22]的研究，在12个烧杯中分别取100 mL剩余污泥，其中6个保持酶浓度在200 mg/g，依次调节pH值为4、5、6、7、8、9，于室温下破胞4 h;另外6个在不加酶的情况下，依次调节pH值为4、5、6、7、8、9，于室温下破胞4 h;依据两者差值即可分析酶单独作用时的最优pH值。
2）酶浓度优化试验。 在7个烧杯中分别取100 mL等浓度的剩余污泥，依次调节烧杯酶浓度为60、90、120、150、200、250、280 mg/g，在确定的最优pH值和室温下破胞4 h，优化出最优酶浓度。
3）时间优化试验。 在7个烧杯中分别取100 mL等浓度的剩余污泥，调节酶浓度及pH值为确定的最优值，室温下依次反应2、3、4、5、6、7、8 h，若此步优化得出的试验结果与前两步优化时所用时间不一致，则用该步骤得到的最优时间重复前两个步骤，得出最终试验结果。
经以上每种因素预处理后的污泥溶液均在8 000 rpm高速冷冻离心机上离心20 min，离心后上清液过0.45 μm滤膜，取滤液进行蛋白质的浓度测定，以得到高效经济的预处理方法及其最优作用条件。
2.4 溶菌酶對提取后蛋白质的影响
以热碱预处理为例，测定热碱预处理后的蛋白质溶液，得到蛋白质浓度值P1。再分别称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的溶菌酶冻干粉加入100 mL水中，得到6种不同浓度的溶菌酶溶液，测定蛋白质浓度依次为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6。取预处理后的蛋白质溶液，分别与6种配制溶菌酶溶液各5 mL进行混合，得到10 mL不同浓度蛋白质混合液，测定蛋白质浓度依次为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。最后检验等式（2）是否成立，以探究溶菌酶对提取后蛋白质浓度的影响。
P1×5+Qx×510=Zx（2）
式中，x的取值范围为1～6。
2.5 等电点回收蛋白质试验条件优化
将试验得到的上清液称为蛋白溶液。在6个烧杯中分别取100 mL 蛋白溶液，利用2 mol/L的硫酸溶液调节其pH值，依次为1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5，然后于-4 ℃冰箱静置1.5 h，将静置后的蛋白溶液于8 000 rpm下离心20 min，得到的上清液过0.45 μm滤膜，取部分滤液分别进行蛋白质浓度测定，剩下的滤液再分别通过纤维素透析袋（截留分子量20 000 Da）纯化备用。
3 结果与讨论
3.1 热碱预处理参数的确定
如图1（a）所示，随着pH值的升高，溶液中蛋白质浓度逐渐升高，在pH为12～13区间显著增加。当pH=13时，溶液中蛋白质浓度达到最大值2 515.55 mg/L（考虑到碱性过高对污泥处理实际意义不大，较高pH值会使污泥产生大量褐变反应[23]，使其中小分子发生聚集，预处理效果反而会降低，故将pH=13设为最大值）。这说明当pH<12时，污泥细胞的溶解程度不高，当pH>12时，污泥溶胞率明显上升。在高温的协助作用下，强碱可以与细胞中的脂类物质发生皂化反应[24]，加速破坏污泥中的细胞结构。除此之外，强碱具有化学和电离的双重作用，更容易使污泥中的微生物细胞发生溶解，进而使胞内物质溶出[25]，故选取pH值为13为最佳碱强度。
如图1（b）所示，热碱处理中蛋白质浓度随着温度的升高而逐渐升高，在140 ℃时达到最大值1 810.87 mg/L，当温度超过140 ℃后，蛋白质浓度呈下降趋势。热碱处理过程中，随着温度的升高，污泥中的微生物絮体结构开始分散，细胞壁和细胞质也在高温的作用下溶解，导致细胞内大量有机物溶出。大分子蛋白质也在高温作用下变成小分子蛋白质，使溶液中蛋白质浓度逐渐升高[26]。与此同时，在碱性条件下，过高的温度会使蛋白质水解为氨基酸，β-氨基酸是其主要成分，而β-氨基酸在高温条件下会发生脱氨反应，生成氨气和不饱和羧酸盐，在强碱条件下，氨气会从溶液中溢出故溶液中溶解性蛋白质的浓度会降低[27]。
图1（c）所示为热碱预处理时间对蛋白质浓度的影响，热碱处理前期，溶液中蛋白质浓度随时间逐渐增加，在处理时间为1.5 h时达到最大值2 068.46 mg/L，后期随着时间的增加，蛋白质浓度缓慢下降。这是因为在热碱反应中胞内物质的释放和蛋白质的水解是同时进行的，在前1.5 h，参照Fan等[28]的试验结论，因为细胞内物质释放速率大于蛋白质的碱性水解作用，故蛋白质浓度呈现上升趋势，1.5 h后，蛋白质的水解速率大于胞内蛋白质溶出速率，故蛋白质浓度呈现下降趋势。Li等[29]的研究结果表明，碱破解污泥细胞的过程分为快速和慢速阶段，大部分的胞内有机物质会在前30 min被释放出来，因此，考虑到经济和溶胞效果，选取1.5 h为最佳预处理时间。
以上3个单因素试验结果确定了热碱处理的最优条件为：pH值13、时间1.5 h、温度140 ℃，与预设条件存在相应误差，可能是因为污泥性质和试验条件的差异。考虑到试验误差情况，取三者蛋白质最大浓度的平均值，即热碱预处理在最佳条件下可使溶液中蛋白质浓度达到2 062.98 mg/L。
3.2 超声碱联合预处理参数的确定
由图2（a）可知，在超声联合碱预处理污泥时，碱的强度至关重要。当pH<12时，随着碱强度的增加，溶液中蛋白质浓度不断增加，在pH值为12时达到最大值488.73 mg/L，当pH>12时，蛋白质浓度开始下降。因为超声波具有破坏污泥絮体结构的作用，当声波能量达到一定值时，污泥絮体结构分散，加大污泥颗粒与碱的接触面积，提高碱对细胞壁的破坏作用，碱性越强对污泥的溶胞效果越明显[30]。但在超声作用下，碱性过强会加快溶液中部分有机物的分解，进而导致溶液中蛋白质含量降低。 图2（b）显示，在预处理时间为30 min、pH值为12的条件下，当功率为1 W/mL时，蛋白质浓度达到388.35 mg/L，当功率继续增加至4 W/mL时，蛋白质浓度逐渐降低，但当功率为5 W/mL时，蛋白质浓度迅速增加至最大值497.89 mg/L，后期随着功率的增加，蛋白质浓度再次呈下降趋势。超声波在联合碱预处理时，主要凭借其空化作用[31]（通过剪切液体形成空化核）和声化学作用[32]（通过超声波加速反应的进行或产生新的化学物质）达到溶胞的目的。在功率由1 W/mL增加到4 W/mL的阶段，蛋白质浓度降低的原因可能是污泥絮体粒径过大，碱未能很好地发挥作用，超声功率的增加反而加快了蛋白质的水解速率。超声与碱联合作用时存在最适功率和最佳粒径的说法[33]，只有污泥经过一定功率的超声后，在剪切作用下分散成最佳粒径大小，这时碱才能发挥其最大破坏作用使细胞内容物流出。试验证明了5 W/mL为该试验条件下的最优功率。
如图2（c）所示，当时间小于30 min时，蛋白质浓度随着时间的增加呈现上升趋势，30 min时达到499.48 mg/L，30 min以后蛋白质浓度趋于平稳。在试验前期，超声波和碱同时起作用，加速了污泥絮体结构的分解和细胞壁的破碎，促使蛋白质浓度不断增加。但反应持续一段时间后，一方面由于碱的消耗导致碱性下降，未能起到跟初期相同的碱解作用，另一方面超声波单独作用时破解细胞需要的能量更大，随着碱解作用的降低，單独的超声作用只能破坏很小一部分污泥细胞，导致后期蛋白质浓度不再有明显增加[34]。
试验结果确定了超声联合碱预处理的最佳条件为：pH值12、功率5 W/mL、时间30 min。相同地，考虑到试验误差取三者蛋白质最大浓度的平均值，即在超声联合碱预处理的最优作用条件下可使溶液中蛋白质浓度达到497.76 mg/L。
3.3 溶菌酶预处理参数的确定
在酶浓度为200 mg/g、时间为6 h的条件下，在pH值跨度4～9的条件下试验研究了pH值的单独作用效果，同时，以相同pH值跨度研究溶菌酶的作用效果，两者的差值即为溶菌酶单独作用时的效果。如图3（a）差值变化曲线所示，当pH值等于7时，酶单独起作用时溶液中蛋白质浓度达到241.06 mg/L，且高于其他任何pH值下的浓度。pH值是影响溶菌酶水解污泥的一个重要因素，过酸或过碱都会对酶发挥其最大活性产生影响。酶分子在不同的pH值溶液中具有不同解离状态，固定的某种解离状态只能与一种底物结合酶活性才能达到最高。除此之外，pH值也会影响酶分子中某些基团的解离，酶底物的专一性、酶分子活性中心的构象等都会影响这些基团的解离状态，进而影响酶的活性[35]。
如图3（b）所示，当酶浓度较低时，溶液中蛋白质浓度随着酶浓度的增高而增高，后期随着酶浓度的增高，蛋白质浓度增加趋势较为平缓。当溶菌酶浓度为200 mg/g时，溶液中蛋白质浓度达到最高值297.14 mg/L。这是因为随着前期酶浓度的增加，底物开始与酶接触反应，促使大量的有机物质由固相转移到液相中，使得溶液中蛋白质浓度逐渐升高。但当反应体系中所有底物与所投加溶菌酶充分接触后，底物几乎已全部与酶分子结合形成络合物[36]，故当酶量增加时，溶液中蛋白质浓度不再显著增加。
如图3（c）所示，当反应时间小于6 h时，随着反应时间的增加，溶液中蛋白质浓度逐渐增加，在6 h时达到271.65 mg/L，当反应时间大于6 h时，蛋白质浓度呈明显降低的趋势。反应时间是酶发挥活性的一个重要因素，只有当在酶与底物充分接触，充分反应之后，污泥才能最大程度地释放其内含物，进而使得溶液中蛋白质浓度上升。在反应的前6 h内，在外界振荡和恒温条件下，酶与剩余污泥不断反应，使得污泥被水解并释放出大量胞内物，导致溶液中蛋白质浓度上升，当大于6 h后，溶菌酶已与底物充分接触反应，此时蛋白质的水解速度大于其释放速度，进而溶液中蛋白质浓度呈下降趋势。
由以上3个因素影响试验确定溶菌酶预处理的最优条件为：pH值7、酶浓度200 mg/g，时间6 h，在最优作用条件下，可使溶液中蛋白质浓度达到269.95 mg/L。
通过对3种方法的结果对比，得出热碱法（2 062.98 mg/L）>超声联合碱法（497.76 mg/L）>溶菌酶法（269.95 mg/L），故选取热碱法进行下一步试验。
经过预处理后的蛋白质可能会发生部分变性，但不影响后期对提取蛋白质粘度特性[37]，故暂时不用考虑蛋白质变性对试验结果的影响。
3.4 溶菌酶对提取后蛋白质的影响结果
如图4所示，A、B、C、D、E、F分别代表提取蛋白质溶液分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL的溶菌酶溶液混合得到的蛋白质浓度理论值与实际值。由图4可以看出，理论值与实际值差距很小，几乎可以忽略，溶菌酶对提取蛋白质浓度几乎无影响。溶菌酶的作用机制主要是针对细胞壁上的肽聚糖，通过肽键上的活性部位水解切断N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，从而达到破坏细胞壁的作用，对蛋白质没有破坏作用，这与试验得出的结论一致[38]。
3.5 等电点回收蛋白质试验结果
图5显示了由热碱法提取的上清液采用等电点法回收蛋白质随pH值的影响，蛋白质回收率随pH值的增加呈先上升后下降的趋势，当pH值为3时，蛋白质的回收率达到最大值62.42%。蛋白质是由多种氨基酸连接而成的生物大分子，两性电解质，在偏酸和偏碱溶液中会分别带正电和负电。通过调节pH值的大小可破坏或削弱分子表面的水化膜和双电层，使分子间引力增加，进而降低蛋白质在溶液中的溶解度，变为沉淀析出[39]。Hwang等[5]发现，在pH值为3.3时城市污泥蛋白质回收率最高，其结论与本研究相符。
4 结论与展望 采用熱碱法、超声碱联合法、溶菌酶法分别对剩余污泥进行预处理，得出最优预处理条件，对比提取效率可看出：热碱法（pH值13、温度140 ℃、时间1.5 h，2 062.98 mg/L）>超声联合碱法（pH值12、功率5 W/mL、时间30 min，497.76 mg/L）>溶菌酶法（pH值7、酶浓度200 mg/g、时间6 h，269.95 mg/L），对热碱法提取的上清液采用等电点法回收蛋白质，在pH值为3时蛋白质的回收率最高，为62.42 %。
剩余污泥中的蛋白质具有较大的利用潜能，但目前蛋白质的提取方法仍存在能耗大、二次污染等问题，许多技术和应用环节还不够成熟，仍需要不断完善。因此，在剩余污泥蛋白质的提取及应用上还可开展大量的研究工作。参考文献：
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（编辑 章润红）