论文部分内容阅读
目的 研究骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)拮抗剂Gremlin1(GREM1)对根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)功能的影响,并探索其机制.方法 体外分离培养SCAPs,免疫荧光染色实验检测GREM1在SCAPs的亚细胞定位;利用GREM1shRNA慢病毒转染,敲低GREM1;分别对GREM1敲低组和对照组SCAPs进行成骨诱导,实时荧光定量PCR(Real time-PCR)和Western blot检测转染后GREM1的敲低效果.取两组细胞,成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,成骨/成牙本质诱导3周后进行茜素红染色,并用Real time-PCR检测成骨诱导0周、1周、2周、3周后成骨/成牙相关基因骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白(DMP1)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)以及成骨/成牙关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、同源盒基因2(DLX2)的表达.取两组细胞,CCK8和流式细胞术检测细胞增殖能力变化;Real time-PCR检测衰老相关基因p53、细胞周期调控因子1(Waf1)和干性相关基因krupple样因子4(KLF4)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)的表达,以及BMPs相关基因(BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9)的表达.结果 免疫荧光实验表明GREM1在胞核内表达量比胞浆中更高;Real time-PCR和Western blot验证了GREM1敲低组的敲低效果.GREM1敲低组ALP活性高于对照组(P<0.05),茜素红染色浅于对照组;OCN、DMP1在1周、2周、3周时表达均有升高,OPN在2周时升高,BSP在3周时升高,DSPP在1周时升高,差异有统计学意义(P<0.05),成骨关键转录因子RUNX2、OSX、DLX2均在不同时段升高,差异有统计学意义(P<0.05).CCK-8法和流式细胞术显示GREM1敲低组增殖能力较对照组下降(P<0.05).与对照组相比,GREM1敲低组BMP2、BMP6、BMP7表达升高,SOX2、KLF4表达升高(P<0.05),P53、Waf1表达下降(P<0.05).结论 GREM1敲低后,能促进SCAPs成骨/成牙分化及干性,抑制SCAPs的增殖及衰老;GREM1对SCAPs的功能作用可能是通过在mRNA水平调控BMP2、BMP6、BMP7的表达实现的.