【摘 要】
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[目的]批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象.转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR (dPCR)方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术.[方法]采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR(ddPCR)的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化
【机 构】
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中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,武汉430062;农业农村部科技发展中心,北京100025
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[目的]批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象.转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR (dPCR)方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术.[方法]采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR(ddPCR)的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100％、10％和6％的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性.[结果]用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因zSSⅡb PCR方法组合,建立NK603/zSSⅡb二重ddPCR方法.二重ddPCR反应体系中NK603转化体和zSSⅡb内标基因的引物/探针浓度相同,均为400 nmol.L-1/200 nmol·L-1,在60℃退火延伸.NK603/zSSⅡb二重ddPCR的检测极限是2 copies DNA模板,定量极限是48 copies DNA模板,动力学范围是10-60000 copies DNA.应用NK603/zSSⅡb二重ddPCR方法可准确定量玉米盲样中的NK603转化体含量,定值结果变异系数小于25％;dPCR定量结果与荧光定量PCR (qPCR)定量结果无显著差异,且具有更高的精确性.[结论]内标基因的选择会影响dPCR定量结果的准确性,在建立dPCR方法的过程中,要用具有准确量值的样品作为质控对照,评估内标准基因的适用性.以人工合成的标准质粒分子pUC57-NK603为质控对照,建立了NK603/zSSⅡb二重ddPCR方法.应用建立的二重ddPCR定值方法进行标准物质的研制和定值,已成功研制出转基因玉米NK603有证标准物质.
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