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摘 要：本文采用高校液相测定了复方双花利咽合剂中绿原酸的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相，检测波长为327nm，流速1.0mL·min-1，柱温：30℃。绿原酸在5～80μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。绿原酸的平均回收率为99.3%，RSD为0.83%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于复方双花利咽合剂中绿原酸的含量测定。
关键词：复方双花利咽合剂；绿原酸；含量
金银花为复方双花利咽合剂主要成分之一。金银花名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。金银花自古被誉为清热解毒的良药。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病。《本经逢原》记载：“金银花，解毒去脓，泻中有补，痈疽溃后之圣药。但气虚脓清，食少便泻者勿用。痘疮倒陷不起，用此根长流水煎浴，以痘光壮为效，此即水杨汤变法。”金银花伤寒杆菌、副伤寒杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎球菌等均有抑制作用。金银花主要包括黄酮类、有机酸类、环烯醚萜类、三萜及三萜皂苷类、挥发油等多种类型成分，绿原酸是其主要有效成分之一。金银花具有抗菌、抗肿瘤、降脂、抗生育、增强免疫、抗炎、利胆、保肝、抗病毒、止血、抗溃疡等多种药理作用。本文采用高校液相测定了复方双花利咽合剂中绿原酸的含量。
1 仪器与试药
美国必能信超声波清洗机（北京星越天成科技有限公司）；EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京皓而普分析设备有限公司）；Aurora-F1实验室自动洗瓶机（杭州喜瓶者生物技术有限公司）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；SUPREMA高速大容量离心机（天美（中国）科学仪器有限公司）；HH-601超级恒温水浴锅（常州市华怡仪器制造有限公司）；实验室用高纯水制备器（北京科誉兴业科技发展有限公司）；美析紫外可见分光光度计（美析（中国）仪器有限公司）。绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（北京亚太龙兴化工有限公司）、冰醋酸（青岛市金宏鑫化工有限公司）、三乙胺（广州市西陇化工有限公司）、甲醇（广州市西陇化工有限公司）、磷酸（北京亚太龙兴化工有限公司）、醋酸钠（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[3-5]。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取复方双花利咽合剂，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70%乙醇50ml，稱定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）25分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml蒸至近干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品约5mg，用甲醇溶解并稀释成每1ml中含20？g的溶液，作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方除金银花以外药材，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在绿原酸出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为5、10、20、40、60、80μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，绿原酸对照品在5～80μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液，精密吸取绿原酸对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.73%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批复方双花利咽合剂样品6份，分别依照2.3项下供试品制0.76%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，10，20，30分钟精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品绿原酸峰面积积分值的RSD为0.67%。结果表明绿原酸至少在30分钟内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的绿原酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.3%，RSD为0.83%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方双花利咽合剂三批样品中绿原酸的含量，含量为7.56mg/g、7.67mg/g、7.92mg/g。
3 讨论
分别考察乙腈-水（35：65），甲醇-水（20：80），水-乙腈-三乙胺（82∶18：0.01），甲醇-水-冰醋酸（20∶80∶1）；甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88），乙腈-1%冰醋酸溶液（20∶80）不同比例的流动相，结果以甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于复方双花利咽合剂中绿原酸的含量测定。复方双花利咽合剂中绿原酸的含量不少于7.0mg/g。
参考文献
[1]陈一强，覃雪军，朱莲娜，宋志军，施焕中，闫萍，郭向华.金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004（09）.
[2]陈娟娟，方建国，万进，冯玲，张亚伟，赵建华，赵晶晶，王楠，陈素华.绿原酸体外抗人巨细胞病毒的实验研究[J].医药导报，2009（09）.
[3]王宏军，吴国娟，李焕荣，于同泉，蒋红，路苹.金银花中绿原酸提取方法的筛选及其抑菌作用[J].北京农学院学报，2003（04）.
[4].符运斌，黄涛，瞿明仁，宋小珍，陈玉敏，杨食堂，杨建军.金银花提取物对热应激肉牛血清激素及抗氧化指标的影响[J]动物营养学报，2016（03）.
[5]宋小珍，符运斌，黄涛，瞿明仁，陈玉敏，杨食堂，杨建军.金银花提取物对高温条件下肉牛抗氧化指标和骨骼肌肌纤维结构的影响[J].动物营养学报，2015（11）.
关键词：复方双花利咽合剂；绿原酸；含量
金银花为复方双花利咽合剂主要成分之一。金银花名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。金银花自古被誉为清热解毒的良药。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病。《本经逢原》记载：“金银花，解毒去脓，泻中有补，痈疽溃后之圣药。但气虚脓清，食少便泻者勿用。痘疮倒陷不起，用此根长流水煎浴，以痘光壮为效，此即水杨汤变法。”金银花伤寒杆菌、副伤寒杆菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎球菌等均有抑制作用。金银花主要包括黄酮类、有机酸类、环烯醚萜类、三萜及三萜皂苷类、挥发油等多种类型成分，绿原酸是其主要有效成分之一。金银花具有抗菌、抗肿瘤、降脂、抗生育、增强免疫、抗炎、利胆、保肝、抗病毒、止血、抗溃疡等多种药理作用。本文采用高校液相测定了复方双花利咽合剂中绿原酸的含量。
1 仪器与试药
美国必能信超声波清洗机（北京星越天成科技有限公司）；EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京皓而普分析设备有限公司）；Aurora-F1实验室自动洗瓶机（杭州喜瓶者生物技术有限公司）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；SUPREMA高速大容量离心机（天美（中国）科学仪器有限公司）；HH-601超级恒温水浴锅（常州市华怡仪器制造有限公司）；实验室用高纯水制备器（北京科誉兴业科技发展有限公司）；美析紫外可见分光光度计（美析（中国）仪器有限公司）。绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙腈（北京亚太龙兴化工有限公司）、冰醋酸（青岛市金宏鑫化工有限公司）、三乙胺（广州市西陇化工有限公司）、甲醇（广州市西陇化工有限公司）、磷酸（北京亚太龙兴化工有限公司）、醋酸钠（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[3-5]。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5um）；甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取复方双花利咽合剂，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人70%乙醇50ml，稱定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）25分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml蒸至近干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品约5mg，用甲醇溶解并稀释成每1ml中含20？g的溶液，作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方除金银花以外药材，按样品制备工艺制成阴性对照样品，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在绿原酸出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为5、10、20、40、60、80μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，绿原酸对照品在5～80μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液，精密吸取绿原酸对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.73%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批复方双花利咽合剂样品6份，分别依照2.3项下供试品制0.76%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，10，20，30分钟精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品绿原酸峰面积积分值的RSD为0.67%。结果表明绿原酸至少在30分钟内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的绿原酸对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.3%，RSD为0.83%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定复方双花利咽合剂三批样品中绿原酸的含量，含量为7.56mg/g、7.67mg/g、7.92mg/g。
3 讨论
分别考察乙腈-水（35：65），甲醇-水（20：80），水-乙腈-三乙胺（82∶18：0.01），甲醇-水-冰醋酸（20∶80∶1）；甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88），乙腈-1%冰醋酸溶液（20∶80）不同比例的流动相，结果以甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用甲醇-乙腈-4%磷酸水（2：10∶88）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于复方双花利咽合剂中绿原酸的含量测定。复方双花利咽合剂中绿原酸的含量不少于7.0mg/g。
参考文献
[1]陈一强，覃雪军，朱莲娜，宋志军，施焕中，闫萍，郭向华.金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004（09）.
[2]陈娟娟，方建国，万进，冯玲，张亚伟，赵建华，赵晶晶，王楠，陈素华.绿原酸体外抗人巨细胞病毒的实验研究[J].医药导报，2009（09）.
[3]王宏军，吴国娟，李焕荣，于同泉，蒋红，路苹.金银花中绿原酸提取方法的筛选及其抑菌作用[J].北京农学院学报，2003（04）.
[4].符运斌，黄涛，瞿明仁，宋小珍，陈玉敏，杨食堂，杨建军.金银花提取物对热应激肉牛血清激素及抗氧化指标的影响[J]动物营养学报，2016（03）.
[5]宋小珍，符运斌，黄涛，瞿明仁，陈玉敏，杨食堂，杨建军.金银花提取物对高温条件下肉牛抗氧化指标和骨骼肌肌纤维结构的影响[J].动物营养学报，2015（11）.