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摘 要: 目的:探讨不同运动方式对心肌FOS蛋白和HSP70表达的影响,从而为运动增进心脏健 康提供理论依据。方法:在不同运动方式动物模型的基础上,采用免疫组化染色方法检测FO S蛋白和HSP70的表达。结果:一次急性运动中,运动后1 hFOS蛋白明显增加,运动后3 h达 到峰值,运动后5 h以后恢复到安静时水平。 HSP70运动后1 h、3 h均明显增加,运动后5 h 达到高峰,持续到运动后12 h;长期耐力运动后,FOS蛋白运动后即刻表达显著增加,运动 后24 h表达有所减少,HSP70运动后即刻和运动后24 h均显著增加。结论:急性运动应激后 ,HSP70表达高峰晚于FOS蛋白,表达时限稍长,FOS蛋白的表达诱导了HSP70的表达。长期耐 力运动应激引起FOS蛋白大量表达,是心肌肥大的一个始动因素;长期耐力运动诱导HSP70高 表达,有助于减少心肌的损伤、促进损伤后的恢复。
关键词:急性运动;耐力运动;FOS;HSP70
中图分类号:G804.7
文献标识码:A
文章编号 :1007-3612(2010)02-0064-04
Effect of Exercise on the Expression of Cardiac FOS and Heat Sho ck Protein 70 in Rats
ZHANG Liqin1,WANG Yunhong2,ZHAO Minghua2,XI Lili2
(1.Inner Mongolia Institute of Sports Science, Hohhot 010030 , Inner Mongolia China;2.Capital Institute of Physical Education, Bei jing 100088 China)
Abstract: The objective of the thesis is to discuss the effect of different mode s of exercise on the expression of cardiac FOS protein and HSP70. Thus it provid es the theory basis for the exercise promoting the cardiac health. It adopts Imm unohistochemistry method to examine FOS protein and HSP70 based on the different
animal exercise models. It finds that in acute exercise, FOS protein increases
obviously in one hour after exercise. FOS protein achieves the peak in three ho urs after exercise, and restores to the level of control group in 5 hours after
exercise. HSP70 significantly increases in one hour after exercise and three ho urs after exercise. HSP70 achieves the peak in five hours after exercise, and c ontinues to 12 hours after exercise; after longterm endurance training, FOS
protein is remarkably increased in 0 hour after exercise. FOS protein is reduced
in 24 hours after exercise. HSP70 obviously increases in 0 hour after exercise
group and 24 hours after exercise group. In conclusion, after acute exercise st ress,the expression peak of HSP70 is later than that of FOS protein, and the
expression time is slightly longer. FOS protein expression induces HSP70 express ion; Longterm endurance exercise stress causes the massive expressions of FOS
protein, hence it is a factor causing cardiac hypertrophy. The longterm endu rance exercise greatly induces the HSP70 expression. It is helpful to reduce the
damage of cardiac muscle and to promote damage restoration.
Key words: acute exercise;endurance exercise;FOS;HSP70
运动是促进心脏健康的重要手段之一,也是心脏的一种刺激因素。在正常心肌原癌 基因c-fos及其产物FOS蛋白和HSP70很少表达, 而在运动等各种理化因子刺激时, 则快速而 明显表达。c-fos参与细胞生长、繁殖、分化、信息传递等生理过程,HSP70是热休克蛋白家 族中在应激状态下表达最强,功能最为重要的一类蛋白,它参与了心肌对缺氧缺血损伤等刺 激的适应性保护机制。研究表明c-fos对诱导HSP70合成起调节作用,并可能是HSP70表达的 始动者。本研究从蛋白表达水平,探讨不同运动方式对心肌FOS蛋白和HSP70表达的影响,并 通过对比一次急性运动和长期耐力运动对心肌FOS蛋白和HSP70表达的不同变化规律,以期对 长期耐力运动所引起的心肌肥大的发生机制提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
实验动物为雄性纯种Sprague-Dawley(SD)大鼠,100只,两月龄,体重(190±10)g,清洁 级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验室温度为(20±2)℃,相对湿度55%～58 %,自然昼夜节律变化光照。按照国家标准啮齿类动物饲料常规喂养,自由饮食。
实验动物随机分为10组,每组10只,组间体重无显著性差异。具体分组方案:
投稿日期:2009-09-07
基金项目:北京市教委科技项目面上基金资助。
作者简介:张丽琴,研究员,硕士,研究方向运动生理与病理。
一次急性运动:安静对照组(Ⅰ)、运动后即刻组(Ⅱ)、运动后1 h组(Ⅲ)、运动后3 h 组(Ⅳ)、运动后5 h组(Ⅴ)、运动后12 h组(Ⅵ)、运动 后24 h组(Ⅶ);长期耐力运动:安静对照组(A)、运动后即刻组(B)、运动后24 h组( C)。
1.2 动物模型的建立
大鼠适应实验环境3 d后开始训练。动物跑台采用国产电动鼠类跑台(杭州生产制造),
训练模型参照Bedford渐增负荷跑台运动模型[1]以及常芸长期耐力跑台运动模型 [2]。安静 对照组为正常笼内生活状态,不运动。一次急性运动各运动组在0°的跑台上以8.2 m/min的 速度运动15 min后,在5°的跑台上以15 m/min的速度运动15 min,然后在10°的跑台上以1 9.3 m/min的速度运动直至力竭。长期耐力运动组每周训练6 d,休息1 d。运动中采取毛刷 刺激维持运动强度。整个训练周期分为三个阶段:第1～4周为加速度加时间阶段,第5～7周 为加坡度阶段,第8～10周为加速度阶段。各运动组运动方案如下:第1周:适应性训练,跑 台10°,速度从14 m/min,每天逐渐递增1 m/min,每天运动20 min;第2～4周:跑台10° ,速度从20 m/min,每天逐渐递增2 m/min,运动时间从30 min,每天递增5 min,直到速度 达到28 m/min,时间达到60 min,之后以这样的速度和时间运动到4周末;第5～6周:跑台1 0°,速度28 m/min运动30 min,随后跑台15°以28 m/min的速度再运动30 min;第7周:跑 台15°,速度28 m/min运动60 min;第8～10周:跑台15°,速度从28 m/min每天递增1 m/m in直到速度达到32 m/min,每天运动60 min,之后保持此速度和时间运动到10周末。末次运 动组以32 m/min运动至力竭。
1.3 实验动物的标本取材 末次造模结束后按照实验设计各时间 点取材。
将大鼠断头处死,立即开胸取出心脏,称心脏重量。结合运动情况和应激状况每组选取 6只大鼠,在大鼠心脏左心室心尖处切取心肌,甲醛溶液固定。心脏标本固定后,放入组织 脱水机内依次酒精脱水,二甲苯透明,最后浸蜡并包埋。使用LEICA RM2135型石蜡切片机切 片,每个标本连续切片5～6张,厚度4 μm,用防脱载玻片贴片,56℃烘烤过夜备用,FOS蛋 白和HSP70的检测采用免疫组化染色方法。
1.4 图像采集及数据处理
免疫组化中棕色颗粒和棕色面积代表FOS蛋白和HSP70的阳性表达。FOS蛋白每张切片随 机选取5个视野(不重复、不重叠),用Leica DM4000 B光学显微镜观察,并在10×20倍下 拍照,用LEICA Qwin图像分析系统测定每个视野中阳性表达的面积百分比和平均灰度级(平 均灰度级越高,阳性信号越弱,反之亦然);HSP70每张切片随机选取10个视野(不重复、 不重叠),在10×40倍下拍照,进行阳性细胞和阴性细胞计数,数据一律以X±s 表示,用SPS S13.0进行统计分析,经单因素方差分析进行组间差异比较。当方差齐性时,用LSD post-ho c检验;当方差不齐时,用Tamhane post-hoc检验。
2 结 果
2.1 心系数的变化
心脏重量是反映心脏肥大的主要指标,一般以心系数(心重/体重)作为判断心脏肥大 的指标。本研究发现,10周耐力训练后运动组大鼠心脏重量和心系数分别增高,运动后即刻 和运动后24 h组心系数较安静对照组均显著增高(P<0.01),说明长期耐力训练后心 脏确实产生了肥大。
表1 心系数的变化
组别体重/g心 重/mg心重/体重/mg•g-1A412.98±27.241 299.94±158.363.15±0.32B361.17±34.901 386.16±189.213.83±0.33**C363.13±43.171 342.92±152.223.72±0.34**
P<0.05,**P<0.01,与A组比较。
2.2 一次急性运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
运动后即刻组较安静对照组FOS蛋白表达有所升高,运动后1 h组与安静对照组有显著 性差异(P<0.05,P<0.01),运动后3 h组FOS蛋白表达最高,与安静对照组有显著性差 异(P<0.01),运动后5 h以后恢复到安静时水平;运动后即刻组较安静对照组HSP70阳 性细胞百分比有所升高,无显著性差异,运动后1 h组、运动后3 h组HSP70阳性细胞百分比 逐渐升高,运动后5 h组达到峰值,运动后12 h组有所下降,四个组均与安静对照组有显著 性差异(P<0.01),运动后24 h组恢复到安静时水平(表2,图1,图3)。
表2 一次急性运动中FOS蛋白和HSP70的变化
组别样 本数FOS蛋白阳性面积百分比FOS蛋白平均灰度级HSP70阳性细胞百分比 Ⅰ6 33.14±11.08197.68±12.9215.34±8.23Ⅱ6 45.72±13.99182.25±18.5719.21±5.40Ⅲ6 50.37±19.29*
169.19±15.07**22.55±7.96** Ⅳ6 53.66±11.03**
160.81±15.90**23.01±4.21
**Ⅴ6 38.57±13.18184.66±23.0324.36±9.15**Ⅵ6 37.65±8.53185.65±22.9321.29±4.88**Ⅶ6 33.67±12.17191.46±26.1718.35±5.63
* P<0.05,**P<0.01,与Ⅰ组比较。
(×200)Ⅰ组
(×200)Ⅳ组
(×200)Ⅶ组
图1
一次急性运动心肌FOS蛋白表达变化
(×200) A组
(×200) B组
(×200)C组
图2 长期耐力运动心肌FOS蛋白表达变化
2.3 长期耐力运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
运动后即刻组FOS蛋白表达较安静对照组显著升高(P<0.01),运动后24 h组恢复到 安静时水平。运动后即刻组、运动后24 h组HSP70阳性细胞百分比均高于安静对照组,有 显著性差异(P<0.01)(表3,图2,图4)。
表3 长期耐力运动中FOS蛋白和HSP70的变化
组别样 本数FOS蛋白阳性面积百分比FOS蛋白平均灰度级HSP70阳性细胞百分比 A641.38±6.93210.65±3.9414.20±5.66B657.67±11.05**201.25±3.61**20.96±7.95** C648.50±13.87207.51±7.8519.24±7.70**
* P<0.05,**P<0.01,与A组比较。(×400) Ⅰ组
(×400)Ⅴ组
(×400)Ⅶ组
图3 一次急性运动心肌HSP70表达变化
(×400)A组
(×400) B组
(×400) C组
图4 长期耐力运动心肌HSP70表达变化
3 分析讨论
3.1 一次急性运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
正常情况下,原癌基因c-fos及其蛋白产物FOS蛋白在绝大多数细胞中呈低水平表达,在 应激情况下,c-fos基因与蛋白作为应激反应基因与蛋白出现,使某些基因的表达发生改变 ,并转而调节其它基因,结果是激活细胞增殖并启动细胞修复过程,有助于可逆性损伤的修 复,起一定的应激和细胞保护作用。目前,对于c-fos和FOS蛋白在心肌缺血应激时表达的研 究较多,而在一次急性运动应激中,FOS蛋白在心肌内的表达的研究较少,许多学者对FOS蛋 白的研究大多集中在脑、骨骼肌等组织,Timofeeva[3]检测了在跑台上运动大鼠安 静时, 运动后即刻和运动后3 h脑皮质、海马等区域c-fosmRNA基因表达的变化,发现运动后即刻c- fosmRNA基因表达明显增加,但运动后2 h已恢复到安静时水平。Hitomi等人[4]让5 名志 愿者以50%VO2max,在功率自行车上运动1 h,结果发现与运动前相比,运动后4 h,骨胳 肌c-fosmRNA表达显著增加。Hollander等人[5]利用电泳泳动度转换测定技术,发 现一次急 性运动后,大鼠骨胳肌FOS蛋白结合活性显著增强。本研究结果表明一次急性运动后即刻FOS 蛋白表达轻度增加,胞核内的c-fos基因被激活,转录形成mRNA,启动其产物FOS蛋白开始表 达;运动后1 hFOS蛋白表达明显增加,运动后3 h与安静对照组有显著性差异,FOS蛋白 进一步表达,发挥生物学效应;运动后5 h以后FOS蛋白表达与安静对照组无显著性差异, 提示FOS蛋白受到运动应激后快速早期表达,但是表达时限不长,被诱导后很快又开始降低 ,可能是由于FOS蛋白表达的增多抑制了c-fos基因的转录。
哺乳类动物细胞胞浆内所含的HSP70主要有两种:HSP73和HSP72。HSP73在正常和应激状 态下机体大部分组织内都能测得其表达,是基础型HSP70;HSP72在正常状态下表达很低,在 机体受到一定量的应激后可被迅速大量合成,称为诱导型HSP70[6]。本实验所测的 HSP70就包含了这两种蛋白的总和。
研究表明, HSP70作为一种细胞内源性保护蛋白,在防止应激引起的细胞损害或修复受 损的细胞方面发挥着重要作用,而且可以作为反映心肌细胞应激或损伤程度的标志。有研究 报道[7],在一次力竭性跑台运动过程中,随着运动时间的延长,HSF的激活增加, 使大鼠心 肌纤维HSP70mRNA表达增加。HSP70理论上具有稳定细胞膜和溶酶体,防止蛋白质变性的作用 。免疫组化研究表明,应激后原先存在于细胞内的结构型HSP70迅速由胞浆移入胞核,诱导 型HSP70逐渐在胞浆中聚积,当结构型和诱导型HSP70在细胞内分布均匀时,出现较强保护作 用。本实验结果显示:一次急性运动后即刻HSP70表达轻度增加,运动后1 h、运动后3 h 均明显增加,运动后5 h达到高峰,持续到运动后12 h,运动后24 h恢复到安静时 水平。这与 Kang[8]等研究结果相一致,他们发现,许多细胞包括心肌细胞HSP70 在应激后 3-5 h合成率最大。还有文献报道,急性运动诱导c-fos基因迅速表达,由于c-fos及其蛋白 的即早表达在其它基因表达中担负了转录因子的作用,它可使某些基因的表达发生改变,从 而激活细胞增殖并启动细胞修复过程,有利于可逆性损伤的修复,但其部分功能可能是通过 HSP70起作用的。因此,急性运动后c-fos基因的表达可能会诱导HSP70的表达[9～11 ],本研究FOS蛋白在心肌表达高峰早于HSP70也证实了这一结论。
3.2 长期耐力运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
本研究结果显示,长期耐力运动应激后,大鼠发生了运动性心肌肥大。运动性心肌肥大 的发生是在神经体液因素调节下,尤其是在心脏分泌的调节肽类物质如心钠素、儿茶酚胺等 ,以及血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等生长因子调控下的一类结构、功能及代谢诸 方面的心脏重塑过程[12]。原癌基因c-fos是这些调节肽类物质和生长因子刺激心 肌细胞肥 大中的直接早期反应基因,也是导致心肌细胞基因表达模式和蛋白合成改变的必须调节因子 。其表达产物FOS蛋白与Jun基因的表达产物JUN蛋白形成异二聚体转录因子AP-1,在细胞内与 DNA结合,作为心肌肥大晚期反应基因的转录调节因子调控晚期反应基因表达[13] 。单铮铮[ 14]等研究显示,自发性高血压大鼠在其左心室肥大(left ventricular hypertrophy, L VH) 的发生、发展过程中均伴随有左心室c-fos基因表达水平的显著升高,证明LVH的形成和发展 过程与心肌组织内c-fos基因高表达有密切联系,c-fos基因激活促进心肌细胞内蛋白质及核 酸合成加速,形成LVH。本研究运动后即刻FOS蛋白表达显著增加,运动后24 hFOS蛋白表 达有所减少,但仍高于安静对照组,这与李昭波等人[11]的研究结果相一致,他们 研究了运 动性和高血压性心肌肥大重塑时c-fos基因表达的变化,结果表明,与安静组相比,游泳训 练12周的大鼠心系数比对照组提高26% ,心肌c-fos基因表达在最后一次运动后即刻明显增强 ,在运动后24 h的稳定期,c-fos基因表达降低,但仍高于对照组。这些结果表明,长期 运动训练所致心肌肥大的发生与c-fos基因及FOS蛋白的表达密切相关。其机制有研究认为, 耐力运动中,诸多调节肽类物质如心钠素、儿茶酚胺等,以及生长因子如血管内皮生长因子 、胰岛素样生长因子等,通过各自在心肌细胞的相应受体激活磷酸肌醇系统, 再经过一系列 中间体的作用, 激活蛋白激酶C, 使细胞内游离钙浓度升高,增高的细胞内游离钙浓度通过 信使作用诱导原癌基因c-fos的初始表达,其表达产物大多数作为次级基因表达的转录因子 启动心肌结构基因的表达, 对心肌细胞增殖起调控作用,产生心肌肥大[15]。由此 说明c-fo s和FOS蛋白的激活,启动了心肌结构蛋白基因的表达,发生心肌肥大,是心肌肥大的一个始 动因素。
本研究长期耐力运动应激后,运动后即刻组、运动后24 h组HSP70表达均 显著高于 安静组,提示长期耐力运动诱导HSP70高表达,运动后24 h仍然很高,这与众多学者的研究 结论是一致的。长期耐力运动使HSP70表达增加的文献报道很多都是有关HSP72的研究。Mora n[16]等人研究耐力运动训练对小鼠心肌HSP72表达的影响,结果显示12周训练后HS P72的含 量显著上升,表明长期的耐力训练能诱导HSP72的表达,说明耐力训练有助于提高心肌HSPs 的基础表达,本研究一次急性运动后24 hHSP70恢复到安静时水平,而长期运动应激后24
hHSP70仍显著高于安静组,也说明这一点。目前,有关长期运动过程中HSP70表达对心肌 细胞的保护作用机制还不十分清楚,本研究分析,一种可能是长期耐力运动增强了心肌细胞 的抗氧化防御能力,另一种可能是HSP70具有分子伴侣作用,直接参与了心肌细胞新合成蛋 白的折叠和装配。可以推测,在10周耐力训练中,要不断地适应运动负荷,每个运动负荷不 适应阶段,HSP70表达都会升高,有助于减少心肌的损伤、促进损伤后的恢复。但是HSP70的 表达在其中只是发挥心肌细胞保护作用,减少损伤促进恢复,还是参与了运动性心肌肥大的 发生和发展过程,目前还没有明确结论,有待于作进一步研究。
本研究表明,FOS蛋白急性运动应激后,能快速早期表达,且表达时限短暂,HSP70急性 应激后亦快速表达,但表达高峰晚于FOS蛋白,表达时限稍长,FOS蛋白的表达诱导了HSP70 的表达;长期耐力运动应激引起FOS蛋白大量表达,FOS蛋白的激活启动了心肌结构蛋白基因 的表达,发生心肌肥大,是心肌肥大的一个始动因素。长期耐力运动诱导HSP70高表达,有 助于减少心肌的损伤、促进损伤后的恢复。
参考文献:
[1] Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,et al.Maximum oxygen consumption of
rats and its changes with various experimental procedures[J].Appl Physiol, 1979,47 (6):1278-1283.
[2] 常芸,林福美,陈小同等.运动心脏结构可复性的研究[J].中国运动医学杂志,1999, 18(3):202-207.
[3] Timofeeva E,Huang Q,Richard D.Effects of treadmill running on brain active -
tion and the corticotropin-releasing hormone system[J].Neuroen-docrino- logy ,2003,77(6):388-405.
[4] Hitomi Y,Kizaki T,Katsumura T,et al.Effects of moderate acute exercise on
ex pression of mRNA involved in the calcineurin signaling pathway in human skeletal
muscle[J].IUBMB Life,2003,55(7):409-413.
[5] Hollander J,Fiebig R,Gore M,et al.Superoxide dismutase gene expression is
activated by a single bout of exercise in rat skeletal muscle[J].Plfugers Ar ch,2001,44(2):426-434.
[6] 叶春,王瑞元,丁益等.热休克对急性运动大鼠骨骼肌中MDA和SOD的影响[J].中国运 动医学杂志,2002,21(3):253-255.
[7] Locke M,Noble EG,Tanguay RM,et al.Activation of heat-shock transcription f actor in rat heart after heat shock and exercise[J].Am J Physiol,1995,268
(6Pt1):1387-1394.
[8] Kang J,Tsokos G.Heat shock protein 70 kDa: molecularbiology[J].Bioche
and Phsiol Pharma Ther,1998,80(2):183-201.
[9] 徐小虎,王曙光,胡丙杰等.急性心肌缺血再灌注HSP70及c-fos的免疫组织化学研究[J ].中国法医学杂志,2001,16(3):129-132.
[10] 谢晓阳,唐晖,魏源.原癌基因c-fos与运动[J].北京体育大学学报,2005,28(5):645 -646.
[11] 李昭波,高云秋,唐朝枢.运动性和高血压性心肌肥大重塑时心肌初级和次级基因的表 达[J].生理学报,1998,50(5):551-556.
[12] 张平.运动与心脏的重塑[J].中国运动医学杂志,2000,19(1):76-80.
[13] Jeong MY,Kinugawa K,Vinson C,et al.AFos dissociates cardiac myocyte hyper -trophy and expression of the pathological gene program[J].Circulation,200 5,111(13):1645-1651.
[14] 单铮铮,戴生明,陈红,等.高血压左心室肥厚与心肌原癌基因c-fos的表达[J].高血 压杂志,1997,5(3):168-171.
[15] 常芸.运动心脏研究的现状与展望[J].山东体育科技,1999,21(4):28-34.
[16] Moran M,Delqado J,et al. Responses of rat myocardial antioxidant defences
and heat shock protein Hsp72 induced by 12 and 24-week treadmill training[J]. Acta Physiol Scand,2004,180(2):157-166.
关键词:急性运动;耐力运动;FOS;HSP70
中图分类号:G804.7
文献标识码:A
文章编号 :1007-3612(2010)02-0064-04
Effect of Exercise on the Expression of Cardiac FOS and Heat Sho ck Protein 70 in Rats
ZHANG Liqin1,WANG Yunhong2,ZHAO Minghua2,XI Lili2
(1.Inner Mongolia Institute of Sports Science, Hohhot 010030 , Inner Mongolia China;2.Capital Institute of Physical Education, Bei jing 100088 China)
Abstract: The objective of the thesis is to discuss the effect of different mode s of exercise on the expression of cardiac FOS protein and HSP70. Thus it provid es the theory basis for the exercise promoting the cardiac health. It adopts Imm unohistochemistry method to examine FOS protein and HSP70 based on the different
animal exercise models. It finds that in acute exercise, FOS protein increases
obviously in one hour after exercise. FOS protein achieves the peak in three ho urs after exercise, and restores to the level of control group in 5 hours after
exercise. HSP70 significantly increases in one hour after exercise and three ho urs after exercise. HSP70 achieves the peak in five hours after exercise, and c ontinues to 12 hours after exercise; after longterm endurance training, FOS
protein is remarkably increased in 0 hour after exercise. FOS protein is reduced
in 24 hours after exercise. HSP70 obviously increases in 0 hour after exercise
group and 24 hours after exercise group. In conclusion, after acute exercise st ress,the expression peak of HSP70 is later than that of FOS protein, and the
expression time is slightly longer. FOS protein expression induces HSP70 express ion; Longterm endurance exercise stress causes the massive expressions of FOS
protein, hence it is a factor causing cardiac hypertrophy. The longterm endu rance exercise greatly induces the HSP70 expression. It is helpful to reduce the
damage of cardiac muscle and to promote damage restoration.
Key words: acute exercise;endurance exercise;FOS;HSP70
运动是促进心脏健康的重要手段之一,也是心脏的一种刺激因素。在正常心肌原癌 基因c-fos及其产物FOS蛋白和HSP70很少表达, 而在运动等各种理化因子刺激时, 则快速而 明显表达。c-fos参与细胞生长、繁殖、分化、信息传递等生理过程,HSP70是热休克蛋白家 族中在应激状态下表达最强,功能最为重要的一类蛋白,它参与了心肌对缺氧缺血损伤等刺 激的适应性保护机制。研究表明c-fos对诱导HSP70合成起调节作用,并可能是HSP70表达的 始动者。本研究从蛋白表达水平,探讨不同运动方式对心肌FOS蛋白和HSP70表达的影响,并 通过对比一次急性运动和长期耐力运动对心肌FOS蛋白和HSP70表达的不同变化规律,以期对 长期耐力运动所引起的心肌肥大的发生机制提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
实验动物为雄性纯种Sprague-Dawley(SD)大鼠,100只,两月龄,体重(190±10)g,清洁 级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验室温度为(20±2)℃,相对湿度55%～58 %,自然昼夜节律变化光照。按照国家标准啮齿类动物饲料常规喂养,自由饮食。
实验动物随机分为10组,每组10只,组间体重无显著性差异。具体分组方案:
投稿日期:2009-09-07
基金项目:北京市教委科技项目面上基金资助。
作者简介:张丽琴,研究员,硕士,研究方向运动生理与病理。
一次急性运动:安静对照组(Ⅰ)、运动后即刻组(Ⅱ)、运动后1 h组(Ⅲ)、运动后3 h 组(Ⅳ)、运动后5 h组(Ⅴ)、运动后12 h组(Ⅵ)、运动 后24 h组(Ⅶ);长期耐力运动:安静对照组(A)、运动后即刻组(B)、运动后24 h组( C)。
1.2 动物模型的建立
大鼠适应实验环境3 d后开始训练。动物跑台采用国产电动鼠类跑台(杭州生产制造),
训练模型参照Bedford渐增负荷跑台运动模型[1]以及常芸长期耐力跑台运动模型 [2]。安静 对照组为正常笼内生活状态,不运动。一次急性运动各运动组在0°的跑台上以8.2 m/min的 速度运动15 min后,在5°的跑台上以15 m/min的速度运动15 min,然后在10°的跑台上以1 9.3 m/min的速度运动直至力竭。长期耐力运动组每周训练6 d,休息1 d。运动中采取毛刷 刺激维持运动强度。整个训练周期分为三个阶段:第1～4周为加速度加时间阶段,第5～7周 为加坡度阶段,第8～10周为加速度阶段。各运动组运动方案如下:第1周:适应性训练,跑 台10°,速度从14 m/min,每天逐渐递增1 m/min,每天运动20 min;第2～4周:跑台10° ,速度从20 m/min,每天逐渐递增2 m/min,运动时间从30 min,每天递增5 min,直到速度 达到28 m/min,时间达到60 min,之后以这样的速度和时间运动到4周末;第5～6周:跑台1 0°,速度28 m/min运动30 min,随后跑台15°以28 m/min的速度再运动30 min;第7周:跑 台15°,速度28 m/min运动60 min;第8～10周:跑台15°,速度从28 m/min每天递增1 m/m in直到速度达到32 m/min,每天运动60 min,之后保持此速度和时间运动到10周末。末次运 动组以32 m/min运动至力竭。
1.3 实验动物的标本取材 末次造模结束后按照实验设计各时间 点取材。
将大鼠断头处死,立即开胸取出心脏,称心脏重量。结合运动情况和应激状况每组选取 6只大鼠,在大鼠心脏左心室心尖处切取心肌,甲醛溶液固定。心脏标本固定后,放入组织 脱水机内依次酒精脱水,二甲苯透明,最后浸蜡并包埋。使用LEICA RM2135型石蜡切片机切 片,每个标本连续切片5～6张,厚度4 μm,用防脱载玻片贴片,56℃烘烤过夜备用,FOS蛋 白和HSP70的检测采用免疫组化染色方法。
1.4 图像采集及数据处理
免疫组化中棕色颗粒和棕色面积代表FOS蛋白和HSP70的阳性表达。FOS蛋白每张切片随 机选取5个视野(不重复、不重叠),用Leica DM4000 B光学显微镜观察,并在10×20倍下 拍照,用LEICA Qwin图像分析系统测定每个视野中阳性表达的面积百分比和平均灰度级(平 均灰度级越高,阳性信号越弱,反之亦然);HSP70每张切片随机选取10个视野(不重复、 不重叠),在10×40倍下拍照,进行阳性细胞和阴性细胞计数,数据一律以X±s 表示,用SPS S13.0进行统计分析,经单因素方差分析进行组间差异比较。当方差齐性时,用LSD post-ho c检验;当方差不齐时,用Tamhane post-hoc检验。
2 结 果
2.1 心系数的变化
心脏重量是反映心脏肥大的主要指标,一般以心系数(心重/体重)作为判断心脏肥大 的指标。本研究发现,10周耐力训练后运动组大鼠心脏重量和心系数分别增高,运动后即刻 和运动后24 h组心系数较安静对照组均显著增高(P<0.01),说明长期耐力训练后心 脏确实产生了肥大。
表1 心系数的变化
组别体重/g心 重/mg心重/体重/mg•g-1A412.98±27.241 299.94±158.363.15±0.32B361.17±34.901 386.16±189.213.83±0.33**C363.13±43.171 342.92±152.223.72±0.34**
P<0.05,**P<0.01,与A组比较。
2.2 一次急性运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
运动后即刻组较安静对照组FOS蛋白表达有所升高,运动后1 h组与安静对照组有显著 性差异(P<0.05,P<0.01),运动后3 h组FOS蛋白表达最高,与安静对照组有显著性差 异(P<0.01),运动后5 h以后恢复到安静时水平;运动后即刻组较安静对照组HSP70阳 性细胞百分比有所升高,无显著性差异,运动后1 h组、运动后3 h组HSP70阳性细胞百分比 逐渐升高,运动后5 h组达到峰值,运动后12 h组有所下降,四个组均与安静对照组有显著 性差异(P<0.01),运动后24 h组恢复到安静时水平(表2,图1,图3)。
表2 一次急性运动中FOS蛋白和HSP70的变化
组别样 本数FOS蛋白阳性面积百分比FOS蛋白平均灰度级HSP70阳性细胞百分比 Ⅰ6 33.14±11.08197.68±12.9215.34±8.23Ⅱ6 45.72±13.99182.25±18.5719.21±5.40Ⅲ6 50.37±19.29*
169.19±15.07**22.55±7.96** Ⅳ6 53.66±11.03**
160.81±15.90**23.01±4.21
**Ⅴ6 38.57±13.18184.66±23.0324.36±9.15**Ⅵ6 37.65±8.53185.65±22.9321.29±4.88**Ⅶ6 33.67±12.17191.46±26.1718.35±5.63
* P<0.05,**P<0.01,与Ⅰ组比较。
(×200)Ⅰ组
(×200)Ⅳ组
(×200)Ⅶ组
图1
一次急性运动心肌FOS蛋白表达变化
(×200) A组
(×200) B组
(×200)C组
图2 长期耐力运动心肌FOS蛋白表达变化
2.3 长期耐力运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
运动后即刻组FOS蛋白表达较安静对照组显著升高(P<0.01),运动后24 h组恢复到 安静时水平。运动后即刻组、运动后24 h组HSP70阳性细胞百分比均高于安静对照组,有 显著性差异(P<0.01)(表3,图2,图4)。
表3 长期耐力运动中FOS蛋白和HSP70的变化
组别样 本数FOS蛋白阳性面积百分比FOS蛋白平均灰度级HSP70阳性细胞百分比 A641.38±6.93210.65±3.9414.20±5.66B657.67±11.05**201.25±3.61**20.96±7.95** C648.50±13.87207.51±7.8519.24±7.70**
* P<0.05,**P<0.01,与A组比较。(×400) Ⅰ组
(×400)Ⅴ组
(×400)Ⅶ组
图3 一次急性运动心肌HSP70表达变化
(×400)A组
(×400) B组
(×400) C组
图4 长期耐力运动心肌HSP70表达变化
3 分析讨论
3.1 一次急性运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
正常情况下,原癌基因c-fos及其蛋白产物FOS蛋白在绝大多数细胞中呈低水平表达,在 应激情况下,c-fos基因与蛋白作为应激反应基因与蛋白出现,使某些基因的表达发生改变 ,并转而调节其它基因,结果是激活细胞增殖并启动细胞修复过程,有助于可逆性损伤的修 复,起一定的应激和细胞保护作用。目前,对于c-fos和FOS蛋白在心肌缺血应激时表达的研 究较多,而在一次急性运动应激中,FOS蛋白在心肌内的表达的研究较少,许多学者对FOS蛋 白的研究大多集中在脑、骨骼肌等组织,Timofeeva[3]检测了在跑台上运动大鼠安 静时, 运动后即刻和运动后3 h脑皮质、海马等区域c-fosmRNA基因表达的变化,发现运动后即刻c- fosmRNA基因表达明显增加,但运动后2 h已恢复到安静时水平。Hitomi等人[4]让5 名志 愿者以50%VO2max,在功率自行车上运动1 h,结果发现与运动前相比,运动后4 h,骨胳 肌c-fosmRNA表达显著增加。Hollander等人[5]利用电泳泳动度转换测定技术,发 现一次急 性运动后,大鼠骨胳肌FOS蛋白结合活性显著增强。本研究结果表明一次急性运动后即刻FOS 蛋白表达轻度增加,胞核内的c-fos基因被激活,转录形成mRNA,启动其产物FOS蛋白开始表 达;运动后1 hFOS蛋白表达明显增加,运动后3 h与安静对照组有显著性差异,FOS蛋白 进一步表达,发挥生物学效应;运动后5 h以后FOS蛋白表达与安静对照组无显著性差异, 提示FOS蛋白受到运动应激后快速早期表达,但是表达时限不长,被诱导后很快又开始降低 ,可能是由于FOS蛋白表达的增多抑制了c-fos基因的转录。
哺乳类动物细胞胞浆内所含的HSP70主要有两种:HSP73和HSP72。HSP73在正常和应激状 态下机体大部分组织内都能测得其表达,是基础型HSP70;HSP72在正常状态下表达很低,在 机体受到一定量的应激后可被迅速大量合成,称为诱导型HSP70[6]。本实验所测的 HSP70就包含了这两种蛋白的总和。
研究表明, HSP70作为一种细胞内源性保护蛋白,在防止应激引起的细胞损害或修复受 损的细胞方面发挥着重要作用,而且可以作为反映心肌细胞应激或损伤程度的标志。有研究 报道[7],在一次力竭性跑台运动过程中,随着运动时间的延长,HSF的激活增加, 使大鼠心 肌纤维HSP70mRNA表达增加。HSP70理论上具有稳定细胞膜和溶酶体,防止蛋白质变性的作用 。免疫组化研究表明,应激后原先存在于细胞内的结构型HSP70迅速由胞浆移入胞核,诱导 型HSP70逐渐在胞浆中聚积,当结构型和诱导型HSP70在细胞内分布均匀时,出现较强保护作 用。本实验结果显示:一次急性运动后即刻HSP70表达轻度增加,运动后1 h、运动后3 h 均明显增加,运动后5 h达到高峰,持续到运动后12 h,运动后24 h恢复到安静时 水平。这与 Kang[8]等研究结果相一致,他们发现,许多细胞包括心肌细胞HSP70 在应激后 3-5 h合成率最大。还有文献报道,急性运动诱导c-fos基因迅速表达,由于c-fos及其蛋白 的即早表达在其它基因表达中担负了转录因子的作用,它可使某些基因的表达发生改变,从 而激活细胞增殖并启动细胞修复过程,有利于可逆性损伤的修复,但其部分功能可能是通过 HSP70起作用的。因此,急性运动后c-fos基因的表达可能会诱导HSP70的表达[9～11 ],本研究FOS蛋白在心肌表达高峰早于HSP70也证实了这一结论。
3.2 长期耐力运动中FOS蛋白和HSP70表达的变化
本研究结果显示,长期耐力运动应激后,大鼠发生了运动性心肌肥大。运动性心肌肥大 的发生是在神经体液因素调节下,尤其是在心脏分泌的调节肽类物质如心钠素、儿茶酚胺等 ,以及血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等生长因子调控下的一类结构、功能及代谢诸 方面的心脏重塑过程[12]。原癌基因c-fos是这些调节肽类物质和生长因子刺激心 肌细胞肥 大中的直接早期反应基因,也是导致心肌细胞基因表达模式和蛋白合成改变的必须调节因子 。其表达产物FOS蛋白与Jun基因的表达产物JUN蛋白形成异二聚体转录因子AP-1,在细胞内与 DNA结合,作为心肌肥大晚期反应基因的转录调节因子调控晚期反应基因表达[13] 。单铮铮[ 14]等研究显示,自发性高血压大鼠在其左心室肥大(left ventricular hypertrophy, L VH) 的发生、发展过程中均伴随有左心室c-fos基因表达水平的显著升高,证明LVH的形成和发展 过程与心肌组织内c-fos基因高表达有密切联系,c-fos基因激活促进心肌细胞内蛋白质及核 酸合成加速,形成LVH。本研究运动后即刻FOS蛋白表达显著增加,运动后24 hFOS蛋白表 达有所减少,但仍高于安静对照组,这与李昭波等人[11]的研究结果相一致,他们 研究了运 动性和高血压性心肌肥大重塑时c-fos基因表达的变化,结果表明,与安静组相比,游泳训 练12周的大鼠心系数比对照组提高26% ,心肌c-fos基因表达在最后一次运动后即刻明显增强 ,在运动后24 h的稳定期,c-fos基因表达降低,但仍高于对照组。这些结果表明,长期 运动训练所致心肌肥大的发生与c-fos基因及FOS蛋白的表达密切相关。其机制有研究认为, 耐力运动中,诸多调节肽类物质如心钠素、儿茶酚胺等,以及生长因子如血管内皮生长因子 、胰岛素样生长因子等,通过各自在心肌细胞的相应受体激活磷酸肌醇系统, 再经过一系列 中间体的作用, 激活蛋白激酶C, 使细胞内游离钙浓度升高,增高的细胞内游离钙浓度通过 信使作用诱导原癌基因c-fos的初始表达,其表达产物大多数作为次级基因表达的转录因子 启动心肌结构基因的表达, 对心肌细胞增殖起调控作用,产生心肌肥大[15]。由此 说明c-fo s和FOS蛋白的激活,启动了心肌结构蛋白基因的表达,发生心肌肥大,是心肌肥大的一个始 动因素。
本研究长期耐力运动应激后,运动后即刻组、运动后24 h组HSP70表达均 显著高于 安静组,提示长期耐力运动诱导HSP70高表达,运动后24 h仍然很高,这与众多学者的研究 结论是一致的。长期耐力运动使HSP70表达增加的文献报道很多都是有关HSP72的研究。Mora n[16]等人研究耐力运动训练对小鼠心肌HSP72表达的影响,结果显示12周训练后HS P72的含 量显著上升,表明长期的耐力训练能诱导HSP72的表达,说明耐力训练有助于提高心肌HSPs 的基础表达,本研究一次急性运动后24 hHSP70恢复到安静时水平,而长期运动应激后24
hHSP70仍显著高于安静组,也说明这一点。目前,有关长期运动过程中HSP70表达对心肌 细胞的保护作用机制还不十分清楚,本研究分析,一种可能是长期耐力运动增强了心肌细胞 的抗氧化防御能力,另一种可能是HSP70具有分子伴侣作用,直接参与了心肌细胞新合成蛋 白的折叠和装配。可以推测,在10周耐力训练中,要不断地适应运动负荷,每个运动负荷不 适应阶段,HSP70表达都会升高,有助于减少心肌的损伤、促进损伤后的恢复。但是HSP70的 表达在其中只是发挥心肌细胞保护作用,减少损伤促进恢复,还是参与了运动性心肌肥大的 发生和发展过程,目前还没有明确结论,有待于作进一步研究。
本研究表明,FOS蛋白急性运动应激后,能快速早期表达,且表达时限短暂,HSP70急性 应激后亦快速表达,但表达高峰晚于FOS蛋白,表达时限稍长,FOS蛋白的表达诱导了HSP70 的表达;长期耐力运动应激引起FOS蛋白大量表达,FOS蛋白的激活启动了心肌结构蛋白基因 的表达,发生心肌肥大,是心肌肥大的一个始动因素。长期耐力运动诱导HSP70高表达,有 助于减少心肌的损伤、促进损伤后的恢复。
参考文献:
[1] Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,et al.Maximum oxygen consumption of
rats and its changes with various experimental procedures[J].Appl Physiol, 1979,47 (6):1278-1283.
[2] 常芸,林福美,陈小同等.运动心脏结构可复性的研究[J].中国运动医学杂志,1999, 18(3):202-207.
[3] Timofeeva E,Huang Q,Richard D.Effects of treadmill running on brain active -
tion and the corticotropin-releasing hormone system[J].Neuroen-docrino- logy ,2003,77(6):388-405.
[4] Hitomi Y,Kizaki T,Katsumura T,et al.Effects of moderate acute exercise on
ex pression of mRNA involved in the calcineurin signaling pathway in human skeletal
muscle[J].IUBMB Life,2003,55(7):409-413.
[5] Hollander J,Fiebig R,Gore M,et al.Superoxide dismutase gene expression is
activated by a single bout of exercise in rat skeletal muscle[J].Plfugers Ar ch,2001,44(2):426-434.
[6] 叶春,王瑞元,丁益等.热休克对急性运动大鼠骨骼肌中MDA和SOD的影响[J].中国运 动医学杂志,2002,21(3):253-255.
[7] Locke M,Noble EG,Tanguay RM,et al.Activation of heat-shock transcription f actor in rat heart after heat shock and exercise[J].Am J Physiol,1995,268
(6Pt1):1387-1394.
[8] Kang J,Tsokos G.Heat shock protein 70 kDa: molecularbiology[J].Bioche
and Phsiol Pharma Ther,1998,80(2):183-201.
[9] 徐小虎,王曙光,胡丙杰等.急性心肌缺血再灌注HSP70及c-fos的免疫组织化学研究[J ].中国法医学杂志,2001,16(3):129-132.
[10] 谢晓阳,唐晖,魏源.原癌基因c-fos与运动[J].北京体育大学学报,2005,28(5):645 -646.
[11] 李昭波,高云秋,唐朝枢.运动性和高血压性心肌肥大重塑时心肌初级和次级基因的表 达[J].生理学报,1998,50(5):551-556.
[12] 张平.运动与心脏的重塑[J].中国运动医学杂志,2000,19(1):76-80.
[13] Jeong MY,Kinugawa K,Vinson C,et al.AFos dissociates cardiac myocyte hyper -trophy and expression of the pathological gene program[J].Circulation,200 5,111(13):1645-1651.
[14] 单铮铮,戴生明,陈红,等.高血压左心室肥厚与心肌原癌基因c-fos的表达[J].高血 压杂志,1997,5(3):168-171.
[15] 常芸.运动心脏研究的现状与展望[J].山东体育科技,1999,21(4):28-34.
[16] Moran M,Delqado J,et al. Responses of rat myocardial antioxidant defences
and heat shock protein Hsp72 induced by 12 and 24-week treadmill training[J]. Acta Physiol Scand,2004,180(2):157-166.