【摘 要】
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目的 寻找新的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗原蛋白并进行原核表达,为牛支原体疫苗的制备奠定基础.方法 采用生物信息学方法分析牛支原体PG45株基因组,发现一种新的膜蛋白p59
【机 构】
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甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;山东省农业科学院奶牛研究中心;中国兽医药品监察所;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州,730070
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目的 寻找新的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗原蛋白并进行原核表达,为牛支原体疫苗的制备奠定基础.方法 采用生物信息学方法分析牛支原体PG45株基因组,发现一种新的膜蛋白p59,并对其理化性质、蛋白定位、是否存在信号肽及其互作蛋白进行分析预测.通过PCR扩增p59蛋白编码基因,经酶切连接表达载体pET-30a(+)后转化人大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达并进行优化,利用不同浓度咪唑洗脱液来洗脱蛋白.通过western blot进行鉴定.制备p59重组蛋白兔多抗,通过粘附试验和支原体生长抑制试验验证该重组蛋白的功能.结果 生物信息学分析该蛋白可能为ABC转运系统的组成蛋白,其互作蛋白为糖、微量元素摄取的ABC转运系统相关蛋白,可能参与牛支原体摄入营养物质的过程.PCR扩增p59基因,双酶切及测序鉴定pET-30a(+)-p59原核表达载体构建正确,SDS-PAGE分析重组载体转化BL21表达p59重组蛋白,相对分子质量为66×103.western blot鉴定该蛋白为膜蛋白,免疫新西兰兔可刺激产生特异性抗体,即具有抗原性.p59蛋白粘附MDBK细胞试验显示,用p59兔多抗作为一抗时的MDBK(Madin-Darby bovinekidney,牛肾细胞)细胞表面能够粘附更多的P59蛋白,表明p59重组蛋白具有一定的粘附能力.生长抑制试验表明,p59兔多抗能抑制牛支原体在固体培养基中的生长,生长抑制率为45.53％.结论 新鉴定的牛支原体膜蛋白p59可能是一种粘附相关蛋白,且具有抗原性,该蛋白多抗血清能抑制支原体的生长,为研究支原体膜蛋白的功能奠定了基础,为牛支原体亚单位疫苗的研制提供了新的靶蛋白.
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