花椰菜种子中萝卜硫素对六种癌细胞作用研究

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   摘 要:目的:萝卜硫素是蔬菜中最有效地抗癌活性之一。该实验研究了萝卜硫素对人宫颈癌细胞系HeLa,人胃癌细胞系BGC-823,人白血病细胞系HL-60,人肺癌细胞系A549,人肝癌细胞系BEL-7402和人乳腺癌细胞系MCF-7的抗癌作用。方法:磺胺嘧啶蛋白染色(SRB法),四唑盐还原法(MTT法)体外细胞筛选试验研究萝卜硫素对六种癌细胞的抗肿瘤活性。结果:表明采用 MTT法,萝卜硫素对人白血病细胞系HL-60具有良好的抑制作用,采用SRB法,萝卜硫素对人肝癌细胞系BEL-7402细胞,人肺癌细胞系 A549,人宫颈癌细胞系 Hela,人胃癌细胞系 BGC-823细胞和人乳腺癌细胞系MCF-7具有良好的抑制作用。
   关键词:西兰花;萝卜硫素;抗癌活性
  据世界卫生组织统计,目前全球每年因癌症死亡的人数为700万,这是一组很沉重的数据,但直到现在,我们还是没有找到攻克癌症的办法。因此,肿瘤的研究和控制是当今生命科学领域的一个主要问题。研究表明,癌症发病率低的地方,人们饮食中的蔬菜、水果所占比例较大,究其原因,是蔬菜水果有一种或多种植物活性成分可以预防或减缓癌症的发生,例如番茄中的番茄红素,大豆制品。大豆异黄酮,浆果中的铋酸,十字花科水果和蔬菜中的萝卜硫素和萜类化合物。它们都被证明具有良好的抗癌和抗癌作用。在许多含有抗癌活性成分的蔬菜中,十字花科(卷心菜,西兰花,西兰花,西兰花,羽衣甘蓝,白萝卜和卷心菜)富含硫代葡萄糖苷(硫代葡萄糖苷)。它可以在蔬菜中的黑芥子酶作用下降解为异硫氰酸酯抗癌物质。
  Sulforaphane是最活跃的异硫氰酸酯类型,硫代葡萄糖苷是硫代葡萄糖苷(它是硫代葡萄糖苷),即通过酶促或酸水解酪氨酸葡萄糖苷酶产生的异硫氰酸酯衍生物,其抗癌作用已在大鼠乳腺癌的治疗中得到证实。实验表明,西兰花中含有丰富的抗癌物质可以减少小鼠胸部肿瘤的形成,防止致癌物的活动。
  本课题使用的萝卜硫素是从花椰菜种子中通过提取,分离和纯化获得,采用磺胺嘧啶蛋白染色法( SRB法),四唑盐还原法( MTT法),对人白血病细胞系 HL-60,人肝癌细胞系 BEL-7402细胞,人肺癌细胞系 A549,人宫颈癌细胞系 Hela细胞,人胃癌细胞系 BGC-823细胞和人乳腺癌细胞系 MCF-7的抗肿瘤活性。
  1.材料和方法
  1.1 仪器
  分析型HPLC:Agilent Technology(1100series),US,C18高效液相色譜柱(大连依利特分析仪器有限公司);电子天平:BSA124S(赛多利斯科学仪器有限公司);超声波清洗器:SG2200HE(上海冠特超声仪器公司);超低温冰箱(-85℃):(Thermo公司);CO2培养箱:Forma 3111型(美国Thermo公司);倒置相差显微镜:Nikon TS100(日本Nikon公司);连续波长酶标仪:Spectra MAX-190(美国Molecular Devices公司);96孔培养板:(美国Costar公司);其他为一般常规仪器。
  1.2 样品与试剂
  样品:萝卜硫素样品由贵州省生化工程中心天然药物化学实验室制得,纯度为85%。
  试药:萝卜硫素对照品购自sigma公司(S-4441;纯度≥90%);乙醇:天津科密欧化学试剂厂;SRB、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜:美国Sigma公司;小牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公;RPMI1640培养基购于Gibco公司;人肝癌细胞株BEL-7402细胞、人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株Hela细胞、人胃癌细胞株BGC-823细胞、人白血病细胞株HL60、人乳腺癌细胞株MCF-7购于上海细胞库。
  1.3 样品制备方法
  准确称取100克花椰菜种子,粉碎至30-60目,加入200毫升水,并在35℃下消化8h。加入800ml无水乙醇,超声浸出60分钟,用定性滤纸过滤,得到萝卜硫素的初始提取物。通过高效液相色谱法测定纯度为约5%。将滤液在AB-8大孔树脂上进行柱层析,并使用800ml乙醇在大孔树脂色谱柱上洗脱萝卜硫素。收集洗脱液,通过高效液相色谱法获得粗萝卜硫素,纯度为约40%。再经过氧化铝柱脱色去杂,可将其纯度提高至60%左右,再经过乙酸乙酯萃取纯化,可得获得纯度为85%左右的萝卜硫素精品。
  1.4萝卜硫素纯度的测定
  (1) 色谱条件:
  色谱柱: Hypersil C18色谱柱(150mm×4.6mm,5?m);流速:0.8mL/min;检测器:紫外检测仪;波长:201nm;灵敏度:0.04AUFS;柱温:35℃;进样体积:10?L;流动相:甲醇-水(20:80)。
  (2)参比溶液的制备:在25mL容量瓶中准确称取5mg萝卜硫素,加入甲醇超声溶解,并稀释至刻度。
  (3)萝卜硫素纯度计算方法:
  萝卜硫素纯度(%)=[0.2(mg·mL-1)×90%×A样×样品体积(mL)]/[A标×样品质量(mg)]
  A样:样品峰面积;A标:样品峰面积
  1.5萝卜硫素抗癌活性试验方法
  (1)MTT法
  四甲基唑啉盐比色试验是检测细胞存活和生长的方法,显影剂四甲基偶氮唑盐是能够接受氢原子的染料。MTT可以通过细胞膜进入细胞,存在于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶被还原成蓝紫色晶体,其不溶于水并沉积在细胞中。 DMSO可以溶解细胞中的蓝紫色晶体(死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失,无法降低 MTT),用酶标仪测量490 nm处的光密度( OD值),可间接反映活细胞的数量;MTT晶体形成的量与一定数量的细胞中的活细胞数成比例。
  (2) SRB法
  是一种蛋白质结合染料,可与三氯乙酸固定的细胞蛋白质的碱性氨基酸结合,形成颜色。呈现亮粉色,通过酶联免疫吸附测定法测量吸光度,其提供敏感的蛋白质蛋白质含量。以此来计算细胞的抑制率。   (3) 体外肿瘤细胞增殖抑制试验方法
  在对数生长期,将细胞悬浮液浓度调节至每孔100μL,接种于96孔细胞培养板中,并在接种后24小时施用(100μL/孔)。分别提供空白对照组,细胞对照组和三个剂量测试药物组(2μg/ mL,20μg/ mL和200μg/ mL)。每種浓度设3 平行孔,每孔加药100?L。继续培养直至测试设计时间,终止培养,并在酶标仪上在490或570nm的波长下测量OD值。
  1.6 实验方案
  (1)细胞培养
  将BEL-7402细胞、A549细胞、Hela细胞、BGC-823细胞、HL-60细胞、 MCF-7细胞采用含有10%的小牛血清的RPMI1640培养基,置于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。待细胞长满瓶底的80%-90%后进行传代实验。
  (2) SRB法测细胞生长的抑制率
  检测方法:磺酰罗丹明蛋白染色法(SRB法)
  模型原理:Sulforhodamine B(SRB)是一种蛋白结合染料,可与生物大分子中的碱性氨基酸结合,其在特定波长范围内的
  OD值与细胞数量呈良好的线形关系。本模型根据SRB结合物的OD值,来检测样品对肿瘤细胞的作用情况。
  计算公式:抑制率(%)=(对照组OD值-样品组OD值)/对照组OD值×100
  (3) MTT法测细胞生长的抑制率
  筛选方法:四氮唑盐还原法(MTT法)
  模型原理:活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶,可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色Formanzan,死细胞此酶消失,MTT不被还原。本模型根据MTT的还原程度,来检测样品对肿瘤细胞的作用情况。
  计算公式:抑制率(%)=(对照组OD值-样品组OD值)/对照组OD值×100%。
  2.实验结果
  2.1萝卜硫素对人肝癌细胞株BEL-7402的活性
  采用磺酰罗丹明蛋白染色法(SRB法),其抑制率的结果如表1所示:
  Table1 The Inhibition rate of the component to the BEL-7402 cells
  结果表明:萝卜硫素20μg/mL时对BEL-7402细胞有较好的抑制作用。
  2.2 萝卜硫素对人肺癌细胞株A549的活性
  采用磺酰罗丹明蛋白染色法(SRB法),其抑制率的结果如表2所示。
  Table2  The inhibition rate of the component to the A549 cells
  结果表明:萝卜硫素20μg/mL对A549细胞有较好的抑制作用。
  2.3 萝卜硫素对人宫颈癌细胞株Hela的活性
  采用磺酰罗丹明蛋白染色法(SRB法),其抑制率的结果如表3所示:
  Table3  The Inhibition rate of the component to the Hela cells
  结果表明:萝卜硫素20μg/mL对Hela细胞有较好的抑制作用。
  2.4萝卜硫素对人胃癌细胞株BGC-823的活性
  采用磺酰罗丹明蛋白染色法(SRB法),其抑制率的结果如表4所示:
  Table 4  The Inhibition rate of the component to the BGC-823 cells
  结果表明:萝卜硫素20μg/mL对BGC-823细胞有较好的抑制作用。
  2.5萝卜硫素对人白血病细胞株HL60的活性
  采用四氮唑盐还原法(MTT法),其抑制率的结果如表5所示:
  Table 5  The Inhibition rate of the component to the HL60 cells
  结果表明:萝卜硫素20μg/mL对HL60细胞有较好的抑制作用。
  2.6萝卜硫素对人乳腺癌细胞株MCF-7的活性
  采用磺酰罗丹明蛋白染色法(SRB法),其抑制率的结果如表6所示:
  Table6  The inhibition rate of the component to the MCF-7 cells
  结果表明:萝卜硫素2μg/mL对MCF-7细胞有较好的抑制作用。
  3讨论
  流行病学研究表明,多吃蔬菜和水果可以预防或减缓癌症和心血管疾病的进展。在许多含有抗癌活性成分的蔬菜中,十字花科蔬菜具有最强的抗癌和抗癌能力,并且经常吃十字花科蔬菜。可以显着降低患胰腺癌,肺癌,结肠癌和前列腺癌的风险。
  实验结果表明,85%纯度的萝卜硫素20μg/ mL通过MTT法对人白血病细胞系HL-60具有良好的抑制作用。85%纯度萝卜硫素20μg/ mL通过SRB法对人肝癌细胞系 BEL-7402细胞,人肺癌细胞系 A549,人宫颈癌细胞系 Hela细胞,人胃癌细胞系 BGC-823细胞和人乳腺癌细胞系 MCF-7具有良好的抑制作用。其中对人乳腺癌细胞系MCF-7效果最强,证明西兰花种
  子中的萝卜硫素对许多人类癌细胞具有强烈的作用。
  参考文献
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  基金项目:贵州省2016年省级大学生创新创业训练计划项目;贵州理工学院教学计划改革项目[《以创新创业为主体的大学生培养模式及评价体系的构建与实践》[2003002061]
  Research effect on six kinds of cancer with sulforaphane in Cauliflower seeds
  XIE Shu-qiong
  Guizhou Institute of Technology  Guiyang 550003   China
  ABSTRACT: Object:Sulforaphane is one of the most effective anticancer activities in vegetables.This experiment studied the sulforaphane in human cervical cancer cell lines HeLa, human gastric cancer cell line BGC-823, human leukemia cell line HL-60, human lung cancer cell lines A549, human liver cancer cell line BEL-7402 and human breast cancer cell lines MCF-7 anti-cancer effect.Method:Sulfadiazine protein staining (SRB method) and tetrazole salt reduction (MTT method) were used to study the antitumor activity of sulforaphane against six types of cancer cells in vitro.Result:MTT assay showed that sulforaphane had a good inhibitory effect on human leukemia cell line hl-60, SRB assay showed that sulforaphane had a good inhibitory effect on human liver cancer cell line bel-7402, human lung cancer cell line A549, human cervical cancer cell line Hela, human gastric cancer cell line bgc-823, and human breast cancer cell line McF-7.
  Keywords: Broccoli; Sulforaphane;antitumor activity
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