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摘 要：为了建立油菜籽中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的快速检测方法，本文采用酶联免疫吸附法，选取不同浓度的提取液、不同种类、不同比例的稀释液检测样本的加标回收率，并进行了准确度、精密度及重复性的评价。结果发现用60%甲醇1︰5、超纯水1︰4稀释检测油菜籽样本中黄曲霉毒素B1的加标回收率为99%～106%，相对标准偏差小于5%。结果表明，酶联免疫吸附法测定油菜籽中黄曲霉毒素B1含量的准确性，重现性，稳定性好，可广泛用于油菜籽中黄曲霉毒素B1的检测。
关键词：AFB1;酶联免疫吸附法;油菜籽
黄曲霉毒素是一组真菌（霉菌）毒素，是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物[1]，广泛存在于花生、大豆等农产品中，是影响花生、大豆、芝麻等农产品油料质量安全的重要因素。黄曲霉毒素具有毒性和强致癌性，毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性[2]。其中黄曲霉毒素B1是目前已知致癌性最强的天然毒素，对人及动物肝脏组织有破坏作用，人、畜摄入了黄曲霉毒素超标的食物或饲料，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，出现肝实质细胞变性、肝硬化等，动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状，可诱发肝癌、胃癌等多种部位的癌症。目前黄曲霉毒素的常规检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法及酶联免疫吸附
法等[3-4]。
油菜是我国传统的油料作物，也是我国主要的油料作物。菜籽油一直是我国居民的传统生活用油，在我国植物油供给结构中，菜籽油居第二位[5]。在菜籽油实际生产中，往往会由油菜籽中引入黄曲霉毒素B1，导致成品菜籽油中可能会含有微量黄曲霉毒素B1。在检测黄曲霉毒素B1的不同方法中，酶联免疫吸附法（ELISA）由于其具有快速、灵敏、准确、操作相对简单，无需昂贵的大型仪器等优点，适用于油菜籽批量筛查检验。本文拟采用ELISA法检测油菜籽中的黄曲霉毒素B1含量，并选取合适的试验条件。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
甲醇（分析纯，国药集团）;乙腈（色谱纯，国药集团）;磷酸氢二钠（分析纯，国药集团）;磷酸二氢钠（分析纯，国药集团）;氯化钠（分析纯，国药集团）;超纯水;HF4500酶标仪（美正集团生物科技有限公司）;高速离心机（湘仪H1850）;电子天平（梅特勒-托利多）;液相色谱（岛津LC-20AT）。
油菜籽样本，孝感市孝南区种植收获采集。黄曲霉毒素B1标准品;黄曲霉毒素B1ELISA检测试剂盒（北京华安麦科生物有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 油菜籽样品前处理
采用60%、70%、80%、90%的甲醇-水作为样本提取液，提取步骤为将油菜籽样品混合均匀并粉碎（广州市旭朗机械多功能切碎机，10～80目），称取5.0 g经粉碎的油菜籽样品，加入25.0 mL上述不同浓度的提取液，在振荡器上振摇10.0 min（转速为200 r/min），然后在4 000 r/min条件下离心5.0 min，过滤取滤液1 mL，再分别加入4 mL、5 mL、9 mL不同体积的水和0.01 M磷酸盐缓冲液进行稀释（即1︰4、1︰5、1︰9稀释），即为样本待测液。
1.2.2 ELISA试剂盒检测样本中AFB1
将酶联免疫试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～25 ℃）平衡30 min，取出微孔板，将样本和标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔盒样本孔所在的位置;根据产品操作流程分别加入标准品或样本50 μL到对应的微孔中，加入AFB1酶标物50 μL/孔，最后再加入AFB1试剂
50 μL/孔，用手轻敲震荡混匀，用避光膜盖住板，置室温环境中反应30 min;反应时间结束后，小心揭开膜，将微孔内液体甩干，用试剂盒中提供的洗涤液300 μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔10 S，然后在吸水纸上拍干;加入底物显色液100 μL/孔，轻敲震荡混匀，用避光膜盖好，置室温环境反应15 min;反应时间结束，加入终止液50 μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪波长A450/A630处测定每孔OD值。
1.3 定量分析方法
采用試剂盒专用的分析软件对结果进行分析，该试剂盒标示灵敏度为0.03 μg/kg，变异系数小于10%。最终检测结果应以实际测定的吸光度，并将对应的稀释倍数换算后计算得出。
2 结果与分析
2.1 油菜籽样本中AFB1的含量
选取5个同一批次，不同区域的样本，用高效液相色谱法GB 5009.22—2016检测其黄曲霉毒素B1含量，结果如表1所示。所测定的5个样品中，有两个油菜籽样品未检出AFB1，其他3个样品均有检出，分别为1.14 μg/kg、0.5 μg/kg、0.15 μg/kg，都未超过国家标准10 μg/kg。因此，本实验以未检出AFB1的油菜籽1为样本，以空白为基底，加标检验回收。
2.2 提取溶剂的选择
分别用60%、70%、80%、90%四种浓度的甲醇-水作为提取液对油菜籽样本进行提取（料液比=1︰5，即5.0 g样本中加入25.0 mL提取液），1︰4水稀释，得到AFB1加标回收率的结果如表1所示（每个加标平行测定3次）。由表1可知，60%甲醇-水提取液对样本的提取效果较为理想，回收率为103.2%。考虑高含量有机试剂对环境及操作人员危害性，及高浓度的甲醇可能会对抗原和抗体的结合产生抑制作用，造成结果的不准确。综合选取60%浓度的甲醇-水提取液为最佳提取溶剂。
2.3 稀释方法的选择
查阅文献可知，提取比例在1︰5时有足够的提取效率，且可得到足够的上清液。固提取比例固定在1︰5，选取不同的稀释比例及稀释液进行优化。由于检出限不能过高，选体积比为1︰4、1︰5、1︰9的不同稀释比例，稀释液分别采用超纯水和0.01 M PBS。结果如表2所示，当提取比例为1︰5，水为稀释液时，稀释比例为1︰4、1︰5、1︰9的3种条件下的回收率分别为104%、110%、96%，都在可接受范围内，且检出限满足要求。当稀释比例为1︰4、1︰5、1︰9，稀释倍数分别是25倍、30倍、50倍，综合考虑检出限及回收率，1︰4的稀释比例更为合适，该方法的倍数为25倍。当0.01 MPBS作为稀释液时，无论何种稀释比例，回收均偏高，且出现假阳性的现象，因此确定该稀释液不适用。
2.4 实际样本的检测
将样本按曲线点添加0 μg/kg、0.75 μg/kg、3 μg/kg、12 μg/kg、50 μg/kg AFB1标准溶液，按照上述60%甲醇1︰5提取，超纯水1︰4稀释，测定样本中AFB1含量，计算回收率，每个浓度测定3次平行。结果如表4所示，回收率在91%～106%，平均回收率为100%。说明60%甲醇1︰5提取，超纯水1︰4稀释测定样本中AFB1含量的准确率高，稳定性较好，完全满足日常监测的需求。
3 展望
传统的酶联免疫方法，利用抗原和抗体结合的原理实现了多种样本的检测，随着人们研究的深入在逐渐扩大，一些特殊样本的检测灵敏度甚至超过了仪器方法。当然在生活水平日益提高的同时，人们对食品安全的关注也越来越高，对不同样本的检测方法提出了更高的要求，例如更便捷、更灵敏、更快速等。目前一些技术在市场上已经有所体现，例如微阵列芯片、电化学传感器、化学发光、微流控、免疫荧光等各种技术都在食品安全检测行业有应用。本文开发的油菜籽方法，在技术上达到其中黄曲霉毒素B1检验的要求，具有高准确度、高精密度、安全性好、快速的特点。为该类样本的检测提供了一个前期基础，希望在未来能够实现更高效、高灵敏的检测。
参考文献
[1]李江，李晓明，綦艳，等.酶联免疫法检测酱油中的黄曲霉毒素B1[J].食品安全质量检测学报，2016（12）：5.
[2]李培武，马良，杨金娥，等.粮油产品黄曲黄曲霉毒素B1检测技术研究进展[J].中国油料作物学报，2014，36（3）：404-408.
[3]李少晖，任丹丹，谢云峰，等.食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015（4）：1107-1115.
[4]蔡正森，钟文辉，张东升，等.ELISA法和HPLC法检测粮油食品中黄曲霉毒素B1含量的比较研究[J].中国卫生检验杂志，2004，14（3）：302-304.
[5]陈静.湖北省油菜产业发展问题研究[D].武汉：华中农业大学，2014.
关键词：AFB1;酶联免疫吸附法;油菜籽
黄曲霉毒素是一组真菌（霉菌）毒素，是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物[1]，广泛存在于花生、大豆等农产品中，是影响花生、大豆、芝麻等农产品油料质量安全的重要因素。黄曲霉毒素具有毒性和强致癌性，毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性[2]。其中黄曲霉毒素B1是目前已知致癌性最强的天然毒素，对人及动物肝脏组织有破坏作用，人、畜摄入了黄曲霉毒素超标的食物或饲料，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，出现肝实质细胞变性、肝硬化等，动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状，可诱发肝癌、胃癌等多种部位的癌症。目前黄曲霉毒素的常规检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法及酶联免疫吸附
法等[3-4]。
油菜是我国传统的油料作物，也是我国主要的油料作物。菜籽油一直是我国居民的传统生活用油，在我国植物油供给结构中，菜籽油居第二位[5]。在菜籽油实际生产中，往往会由油菜籽中引入黄曲霉毒素B1，导致成品菜籽油中可能会含有微量黄曲霉毒素B1。在检测黄曲霉毒素B1的不同方法中，酶联免疫吸附法（ELISA）由于其具有快速、灵敏、准确、操作相对简单，无需昂贵的大型仪器等优点，适用于油菜籽批量筛查检验。本文拟采用ELISA法检测油菜籽中的黄曲霉毒素B1含量，并选取合适的试验条件。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
甲醇（分析纯，国药集团）;乙腈（色谱纯，国药集团）;磷酸氢二钠（分析纯，国药集团）;磷酸二氢钠（分析纯，国药集团）;氯化钠（分析纯，国药集团）;超纯水;HF4500酶标仪（美正集团生物科技有限公司）;高速离心机（湘仪H1850）;电子天平（梅特勒-托利多）;液相色谱（岛津LC-20AT）。
油菜籽样本，孝感市孝南区种植收获采集。黄曲霉毒素B1标准品;黄曲霉毒素B1ELISA检测试剂盒（北京华安麦科生物有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 油菜籽样品前处理
采用60%、70%、80%、90%的甲醇-水作为样本提取液，提取步骤为将油菜籽样品混合均匀并粉碎（广州市旭朗机械多功能切碎机，10～80目），称取5.0 g经粉碎的油菜籽样品，加入25.0 mL上述不同浓度的提取液，在振荡器上振摇10.0 min（转速为200 r/min），然后在4 000 r/min条件下离心5.0 min，过滤取滤液1 mL，再分别加入4 mL、5 mL、9 mL不同体积的水和0.01 M磷酸盐缓冲液进行稀释（即1︰4、1︰5、1︰9稀释），即为样本待测液。
1.2.2 ELISA试剂盒检测样本中AFB1
将酶联免疫试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～25 ℃）平衡30 min，取出微孔板，将样本和标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔盒样本孔所在的位置;根据产品操作流程分别加入标准品或样本50 μL到对应的微孔中，加入AFB1酶标物50 μL/孔，最后再加入AFB1试剂
50 μL/孔，用手轻敲震荡混匀，用避光膜盖住板，置室温环境中反应30 min;反应时间结束后，小心揭开膜，将微孔内液体甩干，用试剂盒中提供的洗涤液300 μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔10 S，然后在吸水纸上拍干;加入底物显色液100 μL/孔，轻敲震荡混匀，用避光膜盖好，置室温环境反应15 min;反应时间结束，加入终止液50 μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪波长A450/A630处测定每孔OD值。
1.3 定量分析方法
采用試剂盒专用的分析软件对结果进行分析，该试剂盒标示灵敏度为0.03 μg/kg，变异系数小于10%。最终检测结果应以实际测定的吸光度，并将对应的稀释倍数换算后计算得出。
2 结果与分析
2.1 油菜籽样本中AFB1的含量
选取5个同一批次，不同区域的样本，用高效液相色谱法GB 5009.22—2016检测其黄曲霉毒素B1含量，结果如表1所示。所测定的5个样品中，有两个油菜籽样品未检出AFB1，其他3个样品均有检出，分别为1.14 μg/kg、0.5 μg/kg、0.15 μg/kg，都未超过国家标准10 μg/kg。因此，本实验以未检出AFB1的油菜籽1为样本，以空白为基底，加标检验回收。
2.2 提取溶剂的选择
分别用60%、70%、80%、90%四种浓度的甲醇-水作为提取液对油菜籽样本进行提取（料液比=1︰5，即5.0 g样本中加入25.0 mL提取液），1︰4水稀释，得到AFB1加标回收率的结果如表1所示（每个加标平行测定3次）。由表1可知，60%甲醇-水提取液对样本的提取效果较为理想，回收率为103.2%。考虑高含量有机试剂对环境及操作人员危害性，及高浓度的甲醇可能会对抗原和抗体的结合产生抑制作用，造成结果的不准确。综合选取60%浓度的甲醇-水提取液为最佳提取溶剂。
2.3 稀释方法的选择
查阅文献可知，提取比例在1︰5时有足够的提取效率，且可得到足够的上清液。固提取比例固定在1︰5，选取不同的稀释比例及稀释液进行优化。由于检出限不能过高，选体积比为1︰4、1︰5、1︰9的不同稀释比例，稀释液分别采用超纯水和0.01 M PBS。结果如表2所示，当提取比例为1︰5，水为稀释液时，稀释比例为1︰4、1︰5、1︰9的3种条件下的回收率分别为104%、110%、96%，都在可接受范围内，且检出限满足要求。当稀释比例为1︰4、1︰5、1︰9，稀释倍数分别是25倍、30倍、50倍，综合考虑检出限及回收率，1︰4的稀释比例更为合适，该方法的倍数为25倍。当0.01 MPBS作为稀释液时，无论何种稀释比例，回收均偏高，且出现假阳性的现象，因此确定该稀释液不适用。
2.4 实际样本的检测
将样本按曲线点添加0 μg/kg、0.75 μg/kg、3 μg/kg、12 μg/kg、50 μg/kg AFB1标准溶液，按照上述60%甲醇1︰5提取，超纯水1︰4稀释，测定样本中AFB1含量，计算回收率，每个浓度测定3次平行。结果如表4所示，回收率在91%～106%，平均回收率为100%。说明60%甲醇1︰5提取，超纯水1︰4稀释测定样本中AFB1含量的准确率高，稳定性较好，完全满足日常监测的需求。
3 展望
传统的酶联免疫方法，利用抗原和抗体结合的原理实现了多种样本的检测，随着人们研究的深入在逐渐扩大，一些特殊样本的检测灵敏度甚至超过了仪器方法。当然在生活水平日益提高的同时，人们对食品安全的关注也越来越高，对不同样本的检测方法提出了更高的要求，例如更便捷、更灵敏、更快速等。目前一些技术在市场上已经有所体现，例如微阵列芯片、电化学传感器、化学发光、微流控、免疫荧光等各种技术都在食品安全检测行业有应用。本文开发的油菜籽方法，在技术上达到其中黄曲霉毒素B1检验的要求，具有高准确度、高精密度、安全性好、快速的特点。为该类样本的检测提供了一个前期基础，希望在未来能够实现更高效、高灵敏的检测。
参考文献
[1]李江，李晓明，綦艳，等.酶联免疫法检测酱油中的黄曲霉毒素B1[J].食品安全质量检测学报，2016（12）：5.
[2]李培武，马良，杨金娥，等.粮油产品黄曲黄曲霉毒素B1检测技术研究进展[J].中国油料作物学报，2014，36（3）：404-408.
[3]李少晖，任丹丹，谢云峰，等.食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015（4）：1107-1115.
[4]蔡正森，钟文辉，张东升，等.ELISA法和HPLC法检测粮油食品中黄曲霉毒素B1含量的比较研究[J].中国卫生检验杂志，2004，14（3）：302-304.
[5]陈静.湖北省油菜产业发展问题研究[D].武汉：华中农业大学，2014.