【摘 要】
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目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值.方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增
【机 构】
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武汉,华中科技大学同济医学院免疫学系
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目的评价捕获噬菌体酶免疫吸附试验法(ELISA)在筛选抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体(scFv)中的价值.方法以含ASGPR基因的质粒(CRDH1/pET3b)为模板,通过聚合酶链反应扩增获得ASGPR H1亚单位糖识别区基因(CRDH1),定向克隆至原核表达载体pET-32c,并经IPTG诱导表达,其表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化;然后,采用捕获噬菌体ELISA对人源噬菌体抗体库进行筛选和鉴定,同时对筛选的抗CRDH1单链抗体进行DNA测序、表达、纯化和免疫印记鉴定.然后,与间接噬菌体ELISA比较.结果 CRDH1/pET-32c在原核系统中经诱导表达出分子量约35 000的融合蛋白,且以包涵体形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白后,采用捕获噬菌体ELISA进行四轮筛选,在60个噬菌体克隆中有45株与CRDH1特异性结合,其中仅1株与重组蛋白标签有交叉结合反应.DNA序列分析表明,有9株DNA序列各异,9株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的scFv,纯化的scFv也可特异性识别rCRDH1.计算该筛选方法的假阳性率为2%,低于间接噬菌体ELISA筛选的假阳性率(58%).结论捕获噬菌体ELISA筛选CRDH1特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签(Trx·Tag)引起的假阳性,提高筛选阳性率,并成功筛选出9株具有rCRDH1特异性的scFv.
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