【摘 要】
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目的 构建人Sec61β基因的表达载体并在大肠埃希菌中表达Sec61β蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究Sec61β蛋白及其自身抗体在人大肠癌诊断中的价值奠定基础.方法 用RT-PCR技
【机 构】
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安徽医科大学 合肥市,230032安徽医科大学病原生物学教研室 合肥市,230032;
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目的 构建人Sec61β基因的表达载体并在大肠埃希菌中表达Sec61β蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究Sec61β蛋白及其自身抗体在人大肠癌诊断中的价值奠定基础.方法 用RT-PCR技术从人大肠癌组织中扩增出Sec61β基因,并与克隆载体pMD18-T连接转入XL1-BLUE克隆菌中,筛选出重组阳性菌落并提取质粒,用EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ将目的基因从重组克隆载体上切下并与同样双酶切后的表达载体pET-28a连接,转入表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达Sec61β重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况.从SDS-PAGE凝胶上切取目的蛋白免疫家兔,获得抗血清.经镍柱纯化后复性获得基因重组蛋白,以该蛋白为抗原,间接ELISA法测定血清抗体效价.Western印迹法检测抗体特异性.结果 成功扩增出Sec61β基因(270 bp),并诱导表达出Sec61β基因工程蛋白,大小约为15 kD,以包涵体形式存在.制备的Sec61β多克隆抗体经Western印迹分析,可与人体组织中目的蛋白特异性结合.结论 成功构建了Sec61β的原核表达载体并在大肠埃希菌表达了人Sec61β蛋白,通过SDS-PAGE凝胶的方法切取重组蛋白免疫家兔获得了特异性多克隆抗体.
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