【摘 要】
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蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)的VP6蛋白(viral structural protein 6)在病毒复制与基因组组装中发挥着重要作用,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,可为VP6蛋白功能研究
【机 构】
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云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒重点实验室,昆明650224;云南农业大学动物医学院,昆明650201
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蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)的VP6蛋白(viral structural protein 6)在病毒复制与基因组组装中发挥着重要作用,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,可为VP6蛋白功能研究及基因工程疫苗研制提供基础资料.本研究通过RT-PCR扩增BTV的VP6基因,分别构建出表达VP6蛋白的原核表达质粒pET32-BTV-VP6与真核表达质粒pCDH-BTV-VP6.将pET32-BTV-VP6转入大肠杆菌(Escherichia coli),在16℃进行诱导培养,VP6重组蛋白部分以可溶形式表达,表达量约为总菌体蛋白的24.5％.采用镍离子亲和层析对表达的VP6重组蛋白进行纯化并免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculu),制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,抗体效价可达1:12000;Western blot与免疫荧光染色证实,制备的多克隆抗体可与BTV感染细胞产生的VP6蛋白发生特异性结合.将真核表达质粒pCDH-BTV-VP6转染BHK-21细胞,使用嘌呤霉素对转染后的细胞进行连续筛选,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系BHK-BTV-VP6;以兔抗VP6多克隆抗体为一抗,进行Western blot与免疫荧光检测,证实VP6蛋白在细胞中稳定表达.本研究实现了BTV VP6重组蛋白在大肠杆菌中的成功表达与纯化,构建了稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,为BTV VP6蛋白功能研究以及新型基因工程疫苗研发提供物质基础.
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