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摘要[目的]采用茎尖分生组织培养脱毒技术培育高唐栝楼的脱病毒试管苗。[方法]对添加不同浓度外源生长调节剂的培养基进行一系列优化试验，筛选出高唐栝楼脱毒试管苗最佳繁殖培养基。[结果]在MS+2.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT培養基中诱导效果较好，技术上达到了快速繁殖规模生产的要求。经反复的病毒检测，证明脱毒试管苗脱病毒彻底。[结论]最终获得了高唐栝楼茎尖培养脱毒与诱导、增殖和生根的培养基，及其生长所需要的外部环境条件和相关配套技术。
关键词高唐栝楼；脱毒；茎尖分生组织；组织培养；快速繁殖
中图分类号S567.23文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0081-03
Technology System for Stemapex Meristem Culture and Rapid Propagation of Trichosanthes kirilowii Maxim.
PENG Xiangqian，LI Guangyong，LIU Hui et al
（College of Pharmaceutical Sciences，Liaocheng University，Liaocheng，Shandong 252059）
Abstract[Objective]Virusfree seedling in test tube of Trichosanthes kirilowii Maxim. was obtained from stemapex meristem culture in vitro. [Method]A series of optimization experiments for propagative medium composition and concentration of phytohormones were investigated with a view to accelerate the propagation of virusfree seedling in test tube of T. kirilowii Maxim. [Result]The most suitable rapid propagative medium of T. kirilowii Maxim. was MS+2.0 mg/L 6BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT. These results could meet the technology requirements of rapid propagation in large scale production. Virusfree seedlings in test tube were tested repeatedly，which had no virus completely. [Conclusion]The cultural mediums of detoxification and induction，proliferation and rooting were obtained as well as the external environmental conditions for the plant growth and matching technology.
Key wordsTrichosanthes kirilowii Maxim.；Virusfree；Stemapex meristem；Tissue culture；Rapid propagation
高唐栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）为葫芦科栝楼属多年生攀缘草本植物，有润肺化痰、养胃生津、利气宽胸等作用[1]。高唐栝楼为山东省1种道地药材，其个大质优，在国内外享有较高的知名度，近年来面积不断扩大，而优质种苗却供应不足。栝楼繁殖一般有种子繁殖和分根繁殖2种方法，但栝楼雌雄异株，且开花前无明显的形态差异，难以分辨，种子繁殖后常出现雄株多（雌雄株比例约为 3∶7）的现象，影响了产量和经济效益，而用分根繁殖，由于块根本身属于药材，同时块根繁殖量不大，且常年无性繁殖会引起种源退化严重，导致优质高唐栝楼种苗数量少[2]。
植物组织培养具有繁殖系数大、脱病毒复壮的优点[3]，组织培养方法应用在栝楼上已有报道，但有关高唐栝楼的组培研究鲜见报道。笔者采用高唐栝楼块根诱导产生幼芽，对幼芽的茎尖分生组织进行培养得到大量的高唐栝楼脱毒试管苗，不仅提高了高唐栝楼的繁殖系数，而且提高了高唐栝楼的产量与质量。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为国家地理标志产品高唐栝楼，取株高唐栝楼根，并做好标记。
1.2方法
1.2.1
供试材料处理。选取无病害且饱满健壮的雌株高唐栝楼根，用自来水将其冲洗干净后，埋于干净的砂土中，保持良好的通风环境，在（25±1）℃条件下进行催芽。待高唐栝楼根上的幼芽高度达1.0～1.5 cm时剥取长势良好的幼芽，蒸馏水冲洗5次，置于45 ℃恒温培养箱中处理5 min，进行脱毒。
将脱毒的幼芽用无菌水冲洗后置于75%乙醇溶液30 s，置于5%次氯酸钠溶液浸泡10 min，取出后用无菌水冲洗6次，置于4 ℃冰箱，备用。
1.2.2培养基对茎尖成苗的影响。取高唐栝楼茎尖分别接种于MS、B5和LS这3种培养基上诱导芽丛，3种培养基均不添加任何外源生长调节剂，计算成苗率，选择培养基。
1.2.3
茎尖大小和成活率关系。剥取不同长度高唐栝楼茎，分别接种到初代培养基MS+ 0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，茎尖明显变绿说明已经成活，比较茎尖大小和成活率的关系。 1.2.4
初代培养。配制初代培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，分装于培养瓶后进行灭菌处理。取备用幼芽，借助解剖镜剥取0.2～0.5 mm的茎尖作为组织培养的外植体，每瓶接种1个，用玻璃纸包扎好瓶口，置于人工气候室，培养环境为光照强度1 500 lx，温度（25±1）℃，光照时间12 h/d，并设置暗时温度（18±1）℃。培养7 d后，观察培养的茎尖明显膨大，呈浅黄色，茎尖随培养时间增长逐渐转绿，20 d后茎尖呈翠绿色。
1.2.5
继一代培养。初代培养20 d后就可以准备进行继一代培养，诱导高唐栝楼幼芽分化，形成芽丛。在第25 天进行转接，继一代培养的培养基、光照和温度等培养条件采用初代培养的条件。第45天大多数的幼芽高度可达2～3 cm，切下芽丛进行继二代培养。
1.2.6
病毒检测。从继一代培养的芽丛上选择1个幼芽，采用酶联免疫吸附法（ELISA）对其进行病毒检测。根据检测结果，选择已完全脱去病毒的芽丛进行继二代培养。
1.2.7
继二代培养和繁殖培养基筛选试验。高唐栝楼继一代培养幼芽进行继二代培养后，观察到采用初始培养基培养的试管苗比较瘦弱，且易玻璃化，因此，对繁殖培养基的配比进行优化筛选。采用正交试验L9（34），探讨6-BA、NAA、KT这3种外源外源生长调节剂对培养效果的影响（表1）。
1.2.8
生根与炼苗。取高约1.5 cm的试管苗接种于生根培养基中进行生根，生根培养基等同于初代培养基。7 d后试管苗开始生根，待试管苗高度为5～6 cm、根为3～5条时，揭盖炼苗，控制温度（25±1）℃、相对湿度90%以上。为防止幼苗失水，在培养瓶中加少许清水，第1～3天瓶盖半开半遮，第4天完全去掉瓶盖。
1.2.9
移栽驯化。将炼苗后的试管苗取出，用清水冲去根上附着的培养基，用多灵1 000倍液蘸根，移栽到营养钵，置于户外简易人工气候室苗床中进行驯化，第1～7天控制温度（25±1）℃、相对湿度90%以上，第7天后，控制温度在20～30 ℃，并逐渐加大通风量，降低湿度，同时增加自然光照强度和时间，使高唐栝楼幼苗逐渐适应自然环境。
2结果与分析
2.1不同培养基对茎尖成苗的影响
取高唐栝楼茎尖分别接种于MS、B5和LS这3种培养基上，诱导芽丛，3种培养基中均不添加任何外源生长调节剂，诱导结果见表2。3种培养基均能诱导芽丛的产生，成苗率为85.0%以上。在MS培养基中成苗率较高，且芽丛健壮，B5和LS这2种培养基中的芽瘦弱，且成苗率相对较低。因此，选择MS作为主要培养基。
2.2茎尖大小和成活率关系
取备用的高唐栝楼幼苗，剥取不同长度的茎尖，分别接种到初始培养基，茎尖明显变绿说明茎尖已经成活。茎尖大小和成活率的关系见表3。
高唐栝楼脱毒过程中，剥取的茎尖大容易成活，但相应的芽丛携带病毒的概率变大，达不到脱毒的效果；剥取的茎尖小攜带病毒的概率降低，但成活率不高，主要由于过小的茎尖顶端含有细胞数目少，导致细胞进一步分裂分化的可能性小[4]。
0.2 mm以下的茎尖容易干枯死亡，且成活率低。经过比较茎尖大小和成活率的关系，发现剥取0.2～0.5 mm的茎尖分生组织培养可以取得较好的效果，因剥取的茎尖相对较小，容易脱水死亡，所以剥取茎尖动作要迅速。
2.3繁殖培养基的筛选
从表4可以看出，3种外源生长调节剂对试管苗平均生长率的影响大小为A（6-BA）、C（KT）、B（NAA）。A（6-BA）因素与试管苗生长率有极显著意义（P<001），C（KT）因素与试管苗生长率有显著意义（P<005），而B（NAA）因素与试管苗生长率没有显著意义，在正交试验中9种培养基试管苗生长率最高为50.2%。优化筛选出高唐栝楼的最佳繁殖培养基为A2B1C3，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT，用筛选得到的最佳培养基进行高唐栝楼试管苗继二代培养，试管苗比较健壮，没有出现玻璃化苗，试管苗生长率为60.5%。
2.4脱毒高唐栝楼苗的病毒检测
对移栽驯化成活后的高唐栝楼脱毒苗进行病毒检测。检测时随机取样，采集叶片1 g置于研钵中，加入10 mL水和5 mL磷酸缓冲液（0.1 mol/L）研磨，取液分别涂抹于叶片2～3次，用600目金钢砂轻轻磨擦，5 min后用清水冲洗叶面，30 d后观察叶片的发病情况[5]。检测结果显示，高唐栝楼脱毒苗的脱毒率为100%。
3结论与讨论
该试验以高唐栝楼茎尖作为外植体，采用茎尖分生组织培养脱毒技术，不经历愈伤组织，一次性成苗，比经历愈伤组织后再转移到分化培养基生根发芽要快，还不会出现遗传上的不稳定性和变异性，同时还能简化育苗程序[6]，降低生产成本。该试验通过高唐栝楼茎尖组织培养，建立了高唐栝楼快速繁殖体系，解决了高唐栝楼以种子繁育雌雄比例不协调的问题，可大量提供优质高唐栝楼组培苗，降低繁育成本，加速优质种苗的繁育进程[7]，同时对高唐栝楼种苗的品种更新及品种遗传改良具有一定的指导意义。
外植体能否再生成功，在很大程度上取决于所选植物的基因型对培养基的适合程度。在培养基的选择上，加入微量外源生长调节剂对茎尖分生组织发育有促进作用，可明显提高高唐栝楼茎尖的成活率，但高浓度的细胞分裂素对芽丛的诱导有利，同时会抑制植物本身生长素的产生，这样植株叶绿素等成分合成无法跟上植物细胞分裂的速度，会产生黄绿色略透明的玻璃化苗[8]。该研究在比较MS、B5、LS这3种培养基对茎尖成苗影响的基础上确定了MS作为基础培养基，并以较低浓度的6-BA、NAA和KT这3种外源生长调节剂的不同配比加入到MS培养基中进行正交试验，最后筛选出的培养基得到了较好的培养效果。正交试验方差分析表明，6-BA和KT这2种外源生长调节剂加入培养基对试管苗生长率的影响比较大，这表明不同基因型的植物对外源生长调节剂的敏感程度是不相同的，所以在培养基中加入外源生长调节剂时要有一定的选择性。
参考文献
[1] 李爱峰，张永清.栝楼的化学成分研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（30）：14713-14716.
[2] 蔡宣梅，郭文杰，张洁，等.福建省道地瓜蒌组织培养体系的建立[J].福建热作科技，2016，41（2）：1-3.
[3] 邵春月，高山林，陈峰，等.怀地黄分生组织培养脱病毒及快速繁殖技术的研究[J].药物生物技术，2008，15（4）：258-261.
[4] 邓才生.人参果脱毒培养与快速繁殖研究[J].云南农业科技，2009（2）：14-15.
[5] 冯果，曾志乾，吴增光，等.基于综合评分法的不同产地加工方法对瓜蒌药材质量的影响[J].安徽农业科学，2017，45（29）：120-123.
[6] 韩琳娜，聂金娥，周凤琴，等.栝楼丛生芽快繁体系的建立[J].山东农业科学，2014，46（3）：46-48.
[7] 崔必波，王伟义，顾闽峰，等.瓜蒌套种麦子节本高产栽培技术初探[J].安徽农业科学，2015，43（28）：75-76，101.
[8] 马维平，黄连超，顾红卫，等.荆半夏组织培养及快速繁殖的研究[J].西北药学杂志，2006，21（2）：57-59.
关键词高唐栝楼；脱毒；茎尖分生组织；组织培养；快速繁殖
中图分类号S567.23文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0081-03
Technology System for Stemapex Meristem Culture and Rapid Propagation of Trichosanthes kirilowii Maxim.
PENG Xiangqian，LI Guangyong，LIU Hui et al
（College of Pharmaceutical Sciences，Liaocheng University，Liaocheng，Shandong 252059）
Abstract[Objective]Virusfree seedling in test tube of Trichosanthes kirilowii Maxim. was obtained from stemapex meristem culture in vitro. [Method]A series of optimization experiments for propagative medium composition and concentration of phytohormones were investigated with a view to accelerate the propagation of virusfree seedling in test tube of T. kirilowii Maxim. [Result]The most suitable rapid propagative medium of T. kirilowii Maxim. was MS+2.0 mg/L 6BA +0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT. These results could meet the technology requirements of rapid propagation in large scale production. Virusfree seedlings in test tube were tested repeatedly，which had no virus completely. [Conclusion]The cultural mediums of detoxification and induction，proliferation and rooting were obtained as well as the external environmental conditions for the plant growth and matching technology.
Key wordsTrichosanthes kirilowii Maxim.；Virusfree；Stemapex meristem；Tissue culture；Rapid propagation
高唐栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）为葫芦科栝楼属多年生攀缘草本植物，有润肺化痰、养胃生津、利气宽胸等作用[1]。高唐栝楼为山东省1种道地药材，其个大质优，在国内外享有较高的知名度，近年来面积不断扩大，而优质种苗却供应不足。栝楼繁殖一般有种子繁殖和分根繁殖2种方法，但栝楼雌雄异株，且开花前无明显的形态差异，难以分辨，种子繁殖后常出现雄株多（雌雄株比例约为 3∶7）的现象，影响了产量和经济效益，而用分根繁殖，由于块根本身属于药材，同时块根繁殖量不大，且常年无性繁殖会引起种源退化严重，导致优质高唐栝楼种苗数量少[2]。
植物组织培养具有繁殖系数大、脱病毒复壮的优点[3]，组织培养方法应用在栝楼上已有报道，但有关高唐栝楼的组培研究鲜见报道。笔者采用高唐栝楼块根诱导产生幼芽，对幼芽的茎尖分生组织进行培养得到大量的高唐栝楼脱毒试管苗，不仅提高了高唐栝楼的繁殖系数，而且提高了高唐栝楼的产量与质量。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为国家地理标志产品高唐栝楼，取株高唐栝楼根，并做好标记。
1.2方法
1.2.1
供试材料处理。选取无病害且饱满健壮的雌株高唐栝楼根，用自来水将其冲洗干净后，埋于干净的砂土中，保持良好的通风环境，在（25±1）℃条件下进行催芽。待高唐栝楼根上的幼芽高度达1.0～1.5 cm时剥取长势良好的幼芽，蒸馏水冲洗5次，置于45 ℃恒温培养箱中处理5 min，进行脱毒。
将脱毒的幼芽用无菌水冲洗后置于75%乙醇溶液30 s，置于5%次氯酸钠溶液浸泡10 min，取出后用无菌水冲洗6次，置于4 ℃冰箱，备用。
1.2.2培养基对茎尖成苗的影响。取高唐栝楼茎尖分别接种于MS、B5和LS这3种培养基上诱导芽丛，3种培养基均不添加任何外源生长调节剂，计算成苗率，选择培养基。
1.2.3
茎尖大小和成活率关系。剥取不同长度高唐栝楼茎，分别接种到初代培养基MS+ 0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，茎尖明显变绿说明已经成活，比较茎尖大小和成活率的关系。 1.2.4
初代培养。配制初代培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA，分装于培养瓶后进行灭菌处理。取备用幼芽，借助解剖镜剥取0.2～0.5 mm的茎尖作为组织培养的外植体，每瓶接种1个，用玻璃纸包扎好瓶口，置于人工气候室，培养环境为光照强度1 500 lx，温度（25±1）℃，光照时间12 h/d，并设置暗时温度（18±1）℃。培养7 d后，观察培养的茎尖明显膨大，呈浅黄色，茎尖随培养时间增长逐渐转绿，20 d后茎尖呈翠绿色。
1.2.5
继一代培养。初代培养20 d后就可以准备进行继一代培养，诱导高唐栝楼幼芽分化，形成芽丛。在第25 天进行转接，继一代培养的培养基、光照和温度等培养条件采用初代培养的条件。第45天大多数的幼芽高度可达2～3 cm，切下芽丛进行继二代培养。
1.2.6
病毒检测。从继一代培养的芽丛上选择1个幼芽，采用酶联免疫吸附法（ELISA）对其进行病毒检测。根据检测结果，选择已完全脱去病毒的芽丛进行继二代培养。
1.2.7
继二代培养和繁殖培养基筛选试验。高唐栝楼继一代培养幼芽进行继二代培养后，观察到采用初始培养基培养的试管苗比较瘦弱，且易玻璃化，因此，对繁殖培养基的配比进行优化筛选。采用正交试验L9（34），探讨6-BA、NAA、KT这3种外源外源生长调节剂对培养效果的影响（表1）。
1.2.8
生根与炼苗。取高约1.5 cm的试管苗接种于生根培养基中进行生根，生根培养基等同于初代培养基。7 d后试管苗开始生根，待试管苗高度为5～6 cm、根为3～5条时，揭盖炼苗，控制温度（25±1）℃、相对湿度90%以上。为防止幼苗失水，在培养瓶中加少许清水，第1～3天瓶盖半开半遮，第4天完全去掉瓶盖。
1.2.9
移栽驯化。将炼苗后的试管苗取出，用清水冲去根上附着的培养基，用多灵1 000倍液蘸根，移栽到营养钵，置于户外简易人工气候室苗床中进行驯化，第1～7天控制温度（25±1）℃、相对湿度90%以上，第7天后，控制温度在20～30 ℃，并逐渐加大通风量，降低湿度，同时增加自然光照强度和时间，使高唐栝楼幼苗逐渐适应自然环境。
2结果与分析
2.1不同培养基对茎尖成苗的影响
取高唐栝楼茎尖分别接种于MS、B5和LS这3种培养基上，诱导芽丛，3种培养基中均不添加任何外源生长调节剂，诱导结果见表2。3种培养基均能诱导芽丛的产生，成苗率为85.0%以上。在MS培养基中成苗率较高，且芽丛健壮，B5和LS这2种培养基中的芽瘦弱，且成苗率相对较低。因此，选择MS作为主要培养基。
2.2茎尖大小和成活率关系
取备用的高唐栝楼幼苗，剥取不同长度的茎尖，分别接种到初始培养基，茎尖明显变绿说明茎尖已经成活。茎尖大小和成活率的关系见表3。
高唐栝楼脱毒过程中，剥取的茎尖大容易成活，但相应的芽丛携带病毒的概率变大，达不到脱毒的效果；剥取的茎尖小攜带病毒的概率降低，但成活率不高，主要由于过小的茎尖顶端含有细胞数目少，导致细胞进一步分裂分化的可能性小[4]。
0.2 mm以下的茎尖容易干枯死亡，且成活率低。经过比较茎尖大小和成活率的关系，发现剥取0.2～0.5 mm的茎尖分生组织培养可以取得较好的效果，因剥取的茎尖相对较小，容易脱水死亡，所以剥取茎尖动作要迅速。
2.3繁殖培养基的筛选
从表4可以看出，3种外源生长调节剂对试管苗平均生长率的影响大小为A（6-BA）、C（KT）、B（NAA）。A（6-BA）因素与试管苗生长率有极显著意义（P<001），C（KT）因素与试管苗生长率有显著意义（P<005），而B（NAA）因素与试管苗生长率没有显著意义，在正交试验中9种培养基试管苗生长率最高为50.2%。优化筛选出高唐栝楼的最佳繁殖培养基为A2B1C3，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L KT，用筛选得到的最佳培养基进行高唐栝楼试管苗继二代培养，试管苗比较健壮，没有出现玻璃化苗，试管苗生长率为60.5%。
2.4脱毒高唐栝楼苗的病毒检测
对移栽驯化成活后的高唐栝楼脱毒苗进行病毒检测。检测时随机取样，采集叶片1 g置于研钵中，加入10 mL水和5 mL磷酸缓冲液（0.1 mol/L）研磨，取液分别涂抹于叶片2～3次，用600目金钢砂轻轻磨擦，5 min后用清水冲洗叶面，30 d后观察叶片的发病情况[5]。检测结果显示，高唐栝楼脱毒苗的脱毒率为100%。
3结论与讨论
该试验以高唐栝楼茎尖作为外植体，采用茎尖分生组织培养脱毒技术，不经历愈伤组织，一次性成苗，比经历愈伤组织后再转移到分化培养基生根发芽要快，还不会出现遗传上的不稳定性和变异性，同时还能简化育苗程序[6]，降低生产成本。该试验通过高唐栝楼茎尖组织培养，建立了高唐栝楼快速繁殖体系，解决了高唐栝楼以种子繁育雌雄比例不协调的问题，可大量提供优质高唐栝楼组培苗，降低繁育成本，加速优质种苗的繁育进程[7]，同时对高唐栝楼种苗的品种更新及品种遗传改良具有一定的指导意义。
外植体能否再生成功，在很大程度上取决于所选植物的基因型对培养基的适合程度。在培养基的选择上，加入微量外源生长调节剂对茎尖分生组织发育有促进作用，可明显提高高唐栝楼茎尖的成活率，但高浓度的细胞分裂素对芽丛的诱导有利，同时会抑制植物本身生长素的产生，这样植株叶绿素等成分合成无法跟上植物细胞分裂的速度，会产生黄绿色略透明的玻璃化苗[8]。该研究在比较MS、B5、LS这3种培养基对茎尖成苗影响的基础上确定了MS作为基础培养基，并以较低浓度的6-BA、NAA和KT这3种外源生长调节剂的不同配比加入到MS培养基中进行正交试验，最后筛选出的培养基得到了较好的培养效果。正交试验方差分析表明，6-BA和KT这2种外源生长调节剂加入培养基对试管苗生长率的影响比较大，这表明不同基因型的植物对外源生长调节剂的敏感程度是不相同的，所以在培养基中加入外源生长调节剂时要有一定的选择性。
参考文献
[1] 李爱峰，张永清.栝楼的化学成分研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（30）：14713-14716.
[2] 蔡宣梅，郭文杰，张洁，等.福建省道地瓜蒌组织培养体系的建立[J].福建热作科技，2016，41（2）：1-3.
[3] 邵春月，高山林，陈峰，等.怀地黄分生组织培养脱病毒及快速繁殖技术的研究[J].药物生物技术，2008，15（4）：258-261.
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[5] 冯果，曾志乾，吴增光，等.基于综合评分法的不同产地加工方法对瓜蒌药材质量的影响[J].安徽农业科学，2017，45（29）：120-123.
[6] 韩琳娜，聂金娥，周凤琴，等.栝楼丛生芽快繁体系的建立[J].山东农业科学，2014，46（3）：46-48.
[7] 崔必波，王伟义，顾闽峰，等.瓜蒌套种麦子节本高产栽培技术初探[J].安徽农业科学，2015，43（28）：75-76，101.
[8] 马维平，黄连超，顾红卫，等.荆半夏组织培养及快速繁殖的研究[J].西北药学杂志，2006，21（2）：57-59.