论文部分内容阅读
目的:研究神经前体细胞表达发育调控样基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like，n NEDD4n L)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制的影响及其可能的分子机制。n 方法:采用Lipofectamine2000分别将靶向n NEDD4n L的小干扰RNA、n NEDD4n L的过表达质粒(pcDNA3.1-n NEDD4n L-HA)、HBV复制质粒(pGEM-HBV1.3)和poly(dAT：dAT)瞬时转染至HepG2细胞，并以可稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测n NEDD4n L、α干扰素、β干扰素、干扰素刺激基因56(interferon-stimulated gene 56，n ISG56)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, n MxA)、寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase，n OAS)等的mRNA水平，以及HBV DNA和3.5 kb HBV RNA的表达水平；采用蛋白质印迹法验证NEDD4L沉默或过表达效果，并检测相关信号分子的蛋白质水平；采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中β干扰素产量。统计学方法采用n t检验。n 结果:HepG2.2.15细胞中的NEDD4L mRNA和蛋白质水平分别为10.53±0.47和4.17±0.43，分别高于HepG2细胞中的1.00±0.05和1.26±0.25，差异均有统计学意义(n t＝3.27，n P＝0.008；n t＝1.68，n P＝0.030)。在敲减n NEDD4n L基因表达的细胞中，上清液HBV DNA表达水平为0.32±0.09，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义(n t＝－0.93，n P＝0.020)；3.5 kb HBV RNA表达水平为0.49±0.11，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义(n t＝－0.68，n P＝0.040)。与对照组相比，n NEDD4n L敲减组的β干扰素、n ISG56、n MxA和n OAS的mRNA相对表达水平均上升，差异均有统计学意义(n t＝4.66、9.38、7.29、7.01，均n P<0.01)。n NEDD4n L敲减组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)刺激时分别为(776.41±115.49) ng/L和(961.21±130.19) ng/L，分别高于对照组的(320.15±56.05) ng/L和(440.17±67.82) ng/L，差异均有统计学意义(n t＝2.43，n P＝0.020；n t＝2.85，n P＝0.030)；n NEDD4n L过表达组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和VSV刺激时分别为(156.18±26.47) ng/L和(176.67±34.51) ng/L，分别低于对照组的(320.38±49.39) ng/L和(440.59±68.83) ng/L，差异均有统计学意义(n t＝－2.03，n P＝0.040；n t＝－1.93，n P＝0.030)。HBV复制下调了β干扰素上游黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)的蛋白质水平，而该下调作用在敲减n NEDD4n L的细胞中并不明显。n 结论:HBV复制能通过促进细胞NEDD4L的表达，下调MDA5而抑制β干扰素的产生，进而辅助HBV的固有免疫逃逸。