油樟叶总黄酮和总多糖的抑菌活性

来源 :江苏农业科学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sakula617
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
  摘要:采用纸片扩散法、二倍稀释法、平板菌落计数法测定了油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌3种细菌的抑菌活性。结果表明,油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制活性均表现出一定的浓度依赖性,其MIC分别为16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL,MBC分别为16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。油樟叶总黄酮和总多糖均明显干扰受试菌的正常生长过程。
  关键词:油樟;黄酮;多糖;抑菌活性
  中图分类号: R285.5文献标志码: A文章编号:1002-1302(2015)11-0408-03
  收稿日期:2014-11-24
  基金项目:四川省基础研究项目(编号:2011JY0050);四川省青年科技创新研究团队培育计划(编号:2011JTD0035);四川省省属高校科研创新团队建设计划(编号:14TD0031)。
  作者简介:杜永华(1978—),男,四川遂宁人,硕士,讲师,主要从事天然产物及其生物活性研究。E-mail:yonghuad@163.com。
  通信作者:魏琴,博士,教授,主要从事植物资源开发利用研究。E-mail:weiqin2011-67@163.com 。油樟[Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N. Chao]属樟科樟属植物,是我国特有树种,主产于四川省宜宾市,其枝叶均富含挥发油,是食品、香料、医药、日用、化工产品的重要原料来源[1-2]。油樟与药用植物香樟[Cinnamomum camphora (Linn.) Presl]为同属植物,均具有多种药理活性。研究表明,油樟叶挥发油具有较强的抗微生物活性[3-6],提取挥发油后的油樟叶残渣提取物具有抗微生物作用[7-10]。目前关于油樟叶提取挥发油后残渣的化学成分及其生物活性研究较少,关于油樟叶中总黄酮的抗菌活性研究未见报道。本试验对油樟叶提取挥发油后残渣中的总黄酮进行抗菌活性研究,旨在为油樟资源的开发利用提供依据。
  1材料与方法
  1.1材料与试剂
  油樟叶采自宜宾市翠屏区邱场乡油樟种植基地;芸香苷标准品(含量≥92.5%,批号100080—200707,中国药品生物制品检定所);D( )-无水葡萄糖标准品(含量≥98%,贵州迪大科技有限责任公司);青霉素G钾盐(1 440 U/mg,Sigma 公司);硫酸链霉素(720 U/mg,Sigma公司);其他化学试剂均为国产分析纯。
  1.2菌种与培养基
  大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均由宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室提供。营养琼脂(NA)液体培养基:0.5 g牛肉膏,1 g蛋白胨,0.5 g氯化钠,加热搅拌溶解于100 mL蒸馏水中,调节pH值至7.3±0.1,121 ℃下高压灭菌20 min,该培养基中加入1.5 g琼脂即为固体培养基。
  1.3主要仪器
  AR2130电子天平(赛多利斯公司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);LG-5A真空冷冻干燥机(上海离心机机械研究所有限公司)。
  1.4方法
  1.4.1油樟叶总黄酮的制备将新鲜油樟叶自然晾干,用水蒸气蒸馏法除去挥发油,残渣(60±1) ℃烘干,粉碎,取过60~80目筛油樟叶粉末50 g,按料液比1 g ∶21 mL加入体积分数为50%的乙醇溶液,室温浸泡36 min,88 ℃水浴回流提取105 min;过滤,滤液于60 ℃减压浓缩至浸膏,加100 mL 蒸馏水溶解,加入适量石油醚萃取至石油醚层无色,取水层浓缩至50 mL,加入乙醇溶液调节乙醇终浓度至80%,4 ℃醇沉过夜(除去多糖、蛋白、鞣质等杂质);过滤,滤液减压浓缩至膏稠状,真空冷冻干燥,得总黄酮粗品。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系[11]测定油樟叶总黄酮含量。将油樟总黄酮粗品用10%乙醇溶液配制成浓度为64.00 mg/mL的储备液,用直径为0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用。
  1.4.2油樟叶总多糖的制备取过60~80目筛除去挥发油的油樟叶干燥粉末50 g,按料液比1 g ∶20 mL加入水,100 ℃水浴回流提取3 h,过滤,滤液浓缩至1/5体积,加入乙醇溶液调节乙醇终浓度至80%,4 ℃醇沉过夜,12 000 r/min冷冻离心5 min,取沉淀真空冷冻干燥,得总多糖粗品。采用苯酚-硫酸法测定油樟叶总多糖含量。将油樟总多糖粗品用无菌水配制成浓度为64.00 mg/mL的储备液,用直径为0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌后备用。
  1.4.3菌株活化及菌悬液制备无菌条件下将保藏菌种接入NA平板培养基,37 ℃恒温培养18~24 h;挑去单个特征菌落接种于5 mL灭菌NA液体培养基中,37 ℃恒温培养18~24 h;取0.5 mL菌悬液加入4.5 mL NA液体培养基中,用血细胞计数板计数,用NA液体培养基稀释菌悬液使其浓度为105~106 CFU/mL[7],备用。
  1.4.4抑菌效果的测定采用纸片琼脂扩散法[12]测定测试物的抑菌效果。将定性滤纸制成直径为6 mm的圆纸片,置于洁净干燥的试管内,121 ℃湿热灭菌20 min后烘干。测定100片滤纸片吸水量,根据吸水量在无菌条件下滴加不同浓度的药液,使油樟总黄酮粗品、总多糖粗品的纸片含药量均分别为512.00、256.00、170.67 μg/片,阳性对照纸片含药量为青霉素G钾盐10 U/片、硫酸链霉素10 μg/片,37 ℃干燥后密闭低温保存备用。取0.5 mL各菌悬液分别涂布于NA平板培养基上,每个平皿放4张含药滤纸,分别为油樟叶总黄酮、总多糖的3个浓度梯度及1个阳性对照,每个浓度3个平行。以放溶剂纸片的加菌培养基为溶剂对照,不加菌培养基为无菌对照。37 ℃恒温培养箱培养24 h,观察是否有抑菌圈,若有,则用游标卡尺测量抑菌圈直径。   1.4.5最小抑菌浓度(MIC)的测定采用二倍稀释法[7]将油樟叶总黄酮粗品、总多糖粗品用相应无菌溶剂稀释成64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL的系列溶液,分别取0.5 mL总黄酮、总多糖溶液至4 mL NA液体培养基中,加入0.5 mL菌悬液,充分摇匀,37 ℃、 115 r/min摇床培养24 h,每个浓度重复3次,同时设无菌对照组(不含菌的NA液体培养基)、溶剂对照组(加相应溶剂的含菌NA液体培养基)。用肉眼观察法观察每支试管中细菌的生长情况,以完全不长菌的浓度为最小抑菌浓度(MIC)。
  1.4.6最小杀菌浓度(MBC)的测定在MIC基础上,从未见细菌生长的试管中取出0.5 mL培养物加入装有4.5 mL NA液体培养基中,37 ℃培养24 h,取0.1 mL培养液用涂布平板法计数,以菌落数少于5个的最低浓度为油樟叶总黄酮、总多糖对该菌的最小杀菌浓度(MBC)[7]。
  1.4.7抑菌曲线的测定参考陶翠等的方法[4],用NA液体培养基将油樟叶总黄酮粗品、总多糖粗品配制成MIC浓度,分别接种3种细菌,使其终浓度为105 CFU/mL,充分混匀后于37 ℃培养,分别于0、2、4、8、12、24、36、48 h吸取1.0 mL菌液,按10倍比例稀释,加入19 mL NA培养基混匀后制成平板,37 ℃培养24 h后计算菌落,根据稀释浓度计算1 mL活菌数,以菌落数的对数为因变量,以培养时间为自变量在直角坐标系中作图,即得油樟叶总黄酮或总多糖对细菌的时间抑菌曲线,同时设含相应菌的培养基空白对照。
  2结果与分析
  2.1油樟叶总黄酮、总多糖含量测定
  50 g提取挥发油后的油樟叶渣经醇提法提取总黄酮,冷冻干燥获得油樟叶总黄酮粗品4.60 g,经比色法测得油樟叶总黄酮粗品中总黄酮含量为381.83 mg/g,油樟叶总黄酮提取率为3.51%;获得油樟叶总多糖粗品2.65 g,经苯酚-硫酸法测定总多糖粗品中总多糖含量为371.22 mg/g,总多糖提取率为1.97%。
  2.2油樟叶总黄酮、总多糖的抑菌效果
  由表1可知,油樟叶总黄酮、总多糖粗品对3株细菌均具有一定的抑菌作用,其抑菌圈直径随着纸片含药量的增加而增加,表现出一定的剂量依耐性,但均低于阳性对照组。油樟总黄酮粗品对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌圈基本上大于油樟总多糖粗品,但油樟总多糖粗品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大于油樟总黄酮粗品。阳性药物组对相应细菌的抑菌圈均达到美国抗微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)的敏感水平,溶剂对照组、无菌对照组均无异常现象。512.0 μg/片油樟总黄酮粗品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径是10 U/片青霉素G钾盐的30.3%,对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径是青霉素G钾盐的50.0%。
  2.3油樟叶总黄酮、总多糖的最小抑菌浓度
  由表2可知,无菌对照组无菌生长,溶剂对照组有菌生长。油樟叶总黄酮和总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为16.000、8.000、16.000 mg/mL和16.000、16.000、32.000 mg/mL。
  2.4油樟叶总黄酮、总多糖的最小杀菌浓度
  由表3可知,无菌对照组无菌生长,溶剂对照组有菌生长。油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌作用24 h后的最小杀菌浓度分别为16.000、16.000、32.000 mg/mL和16.000、32.000、64.000 mg/mL。
  2.5油樟叶总黄酮、总多糖抑菌曲线
  由图1至图3可知,3种细菌在溶剂对照中均能正常生长,有较明显的调整期、对数期、稳定期、衰亡期。油樟叶总黄酮、总多糖在1倍MIC下,金黄色葡萄球菌均直接进入了衰亡期,表现出明显的杀菌作用;1倍MIC总黄酮使枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的调整期延长,无明显对数期、稳定期,24 h内缓慢生长,但活菌数量较溶剂对照组低,随即进入衰亡期;
  3结论与讨论
  本试验结果表明,油樟叶总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均具有一定的抑菌活性,其抑菌效果随着总黄酮、总多糖浓度的增加而增强。油樟总黄酮对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC与总多糖相同,说明总黄酮、总多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用相当。总黄酮对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的MIC、MBC均低于总多糖,表明总黄酮对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制作用强于总多糖。这一现象与光石韦总黄酮和多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的作用趋势相似[12]。油樟叶总黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性(MIC均为16.000 mg/mL)强于油樟叶乙醇提取物 (MIC均为31.25 mg/mL)[7]。与油樟同属植物香樟叶在除去挥发油后的乙醇提取物主要成分为黄酮类化合物,其黄酮类化合物提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均有较强抗菌活性[13-14]。由此可知,油樟叶总黄酮可能是油樟叶乙醇提取物中主要的抑菌成分。油樟叶总多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性(MIC分别为16.000、32.000 mg/mL)弱于香樟叶水提取物(MIC均为15.63 mg/mL)[15]。孙崇鲁研究表明,香樟叶水提取物含有较多的多糖成分[16]。但油樟叶总多糖的抑菌活性是否弱于香樟叶总多糖还有待进一步研究。
  参考文献:
  [1]吴征镒,孙航,周浙昆,等. 中国植物区系中的特有性及其起源和分化[J]. 云南植物研究,2005,27(6):577-604.
  [2]罗中杰,李维一,魏琴,等. 宜宾油樟的现状及未来[J]. 四川师范大学学报:自然科学版,2001,24(3):317-319.
其他文献
摘要:以不动杆菌(Acinetobacter indicus)JL-1为菌种,使用无机磷液体培养基测定其解磷性能。采用单因素试验与正交试验确定最佳解磷条件:碳源为10.0 g/L蔗糖,2.0 g/L复合氮源(硫酸铵与酵母粉质量浓度比为1 ∶ 1),pH值为7.5,温度为37 ℃,装液量为50 mL/250 mL。在此最优条件下,解磷量在48 h时最高,为61.02 μg/mL,菌落数为2.69×1
摘要:为分析循环水养殖和池塘养殖下加州鲈鱼肉质区别,探索循环水养殖模式优点。采集同龄段、同一饲料喂养的2种养殖模式下的加州鲈鱼,通过测定加州鲈鱼的基础营养成分、肉质相关指标和质构特性(TPA分析)来评价2种养殖模式下鲈鱼肉质,并采用扫描电镜,对2种加州鲈鱼进行观察,分析其微观结构差异。結果显示,循环水养殖加州鲈鱼较池塘养殖比,其粗蛋白含量显著提高(P<0.05),粗脂肪含量显著降低(P<0.05)
奶奶去世的时候,我始终不愿相信,她真的离开了我,那个每个周末都等我回家吃饭的人不在了,不能陪她一起在小区遛弯了,再也听不到她的碎碎念了,我以后再也见不到她了,眼泪一滴一滴,打湿了枕巾。  追悼仪式中午开始,我跟着人群走進悼念厅,听着在念悼词的工作人员刻意夸张的语调,我甚至还可以看到人群前奶奶穿着的蓝色带花纹的衣服……然后送去火化,周围的亲戚号啕大哭,而我呆呆地望着人们……  奶奶其实是因为一次摔倒
摘要:通过食用液相-质谱联用方法研究河南安阳、江苏盐城、贵州贵阳、广东广州、浙江杭州及湖北湘潭等6地菊花啶虫脒的残留降解规律,为菊花病虫害防治以及菊花中的啶虫脒残留分析提供参考。以菊花为试材,建立啶虫脒在菊花上的液相色谱-三重四极杆串联质谱(HPLC-MS/MS)测定方法,并使用该方法研究啶虫脒在菊花上的残留量动态变化和最终残留量。结果表明,以啶虫脒标准溶液的质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,啶虫
摘要:探究不同物候型小麦品种晚播后产量性状变化及品质差异,并优化栽培播期。在同一播量下晚播,以生殖物候极稳定的优质强筋小麦品种小偃81和生殖物候极不稳定的中筋品种西农1376为材料,研究晚播后产量性状及品质指标变化,并以基因环境互作分析软件对品质指标进行系统分析。结果表明,播期与抽穗期极显著正相关,西农1376产量与播期及抽穗期极显著负相关,小偃81产量与播期极显著负相关,西农1376千粒质量与产
摘要:以马铃薯宾杰(Bintje)品种为试验材料,研究在马铃薯基础培养基中添加不同外源激素及添加物对马铃薯组培苗生长的影响。结果表明,最适于组培苗增殖的激素配比为2.00 mg/L 6-BA 0.01 mg/L NAA,最适于其结薯和生根的激素配比为2.00 mg/L 6-BA 1.00 mg/L NAA。在培养基中添加马铃薯比添加香蕉更有利于马铃薯组培苗叶片的生长,最适添加浓度为100 g/L;
摘要:以4种植物生长延缓剂或生长抑制剂为材料,采用种子包衣的方式,分析种用化控剂对不同品种玉米种子萌发及幼苗生长特性的影响。结果表明,种用化控剂明显延缓玉米幼苗地上部的生长发育,明显降低幼苗干质量、株高、胚芽鞘长度,其中对后2种指标的影响达显著水平(P<0.05);可显著促进根系的生长与发育,提高根表面积和根长度,进而提高根冠比;品种之间对不同药剂的反应存在一定差异。因此,采用化控剂包衣的方式有可
摘要:鬼伞是一类菌柄能在短时间内快速伸长并且伞盖易自溶形成墨汁的蘑菇,菌柄在伸长过程中细胞壁以伸长生长为主,细胞壁组分β-1,3-葡聚糖发生重构修饰,GH72家族的β-1,3-葡聚糖转移酶能够将较低聚合度的寡糖转化生成更高聚合度的糖链。β-1,3-葡聚糖转移酶可能参与鬼伞菌柄细胞壁中β-葡聚糖组分的重构修饰。以完成测序并有注释信息的灰盖拟鬼伞(Coprinopsis cinerea)、拟鬼伞(Co
摘要:为提高小样本茶树病害识别的准确率,提出一种基于2次迁移模型的卷积神经网络茶树病害图像识别方法。首先将ResNet模型在ImageNet数据集上进行预训练,然后将预训练模型對植物病害数据集进行参数迁移训练,最后将迁移学习训练后的模型对扩充后的小样本茶树病害数据集进行2次参数迁移训练。结果表明,扩充后的数据集识别准确率较原数据集提高2.32%,再进行2次迁移学习后识别准确率又提高6.38%。通过
一篇文章,特别是一个故事的开头几乎决定了读者是否会继续阅读下去。精彩的开头,会一下子抓住读者的眼球,只需一句话就能让读者立刻沉入到故事里,随着叙述者进入到小说的世界。  开头的方法有很多种,有的精彩,如麻辣烫一样,只吃上一口,那麻辣鲜香就让人瞬间“沉沦”;有的平实,如一杯蜂蜜水,入口略淡,读下去却滋味悠长……  开头的不同,是取决于文章所写的整体内容的差异。开头的方式,更是取决于作者在落笔之前心中