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摘要：花药培养是作物育种中一种重要的辅助育种技术。文章对影响西瓜花药培养的主要因素。如基因型、小孢子发育时期、培养基、碳源、生长调节剂、活性炭、三十烷醇等研究进展进行了综述，并针对西瓜花药培养中存在的问题提出了今后研究的方向。
关键词：西瓜；花药培养；基因型；培养基；碳源；生长调节剂；活性炭
西瓜(Citrullus lanatus)又称夏瓜、寒瓜，堪称瓜中之王。因在汉代从西域引入，故称西瓜。属葫芦科，西瓜属，一年生草本植物。与大多数作物相比，西瓜品种间同源性较高，遗传基础非常狭窄，所以，有必要拓宽西瓜的种质遗传基础，为遗传育种做贡献。单倍体尤其是双单倍体与分子生物学、基因工程、诱变育种相结合，可以加速育种进程，并能更好地改良西瓜遗传基础，产生更多的高抗优质高产品种，同时丰富品种的多样性。单倍体不存在显隐性问题，产生的隐性突变在第1代即可表现出来。其基因型完全可以由表现型反映出来，有利于鉴定和选择。再者，利用花药和花粉培养的胚状体或愈伤组织不仅可以作为基因工程的受体进行基因转化，而且可以快速获得符合育种目标的植株，提高育种效率。
在西瓜上自发产生单倍体的频率极低，为了获得西瓜单倍体。国内外研究者主要通过离体雄核发育(in vitro androgenesis，即花粉——小孢子培养)、离体雌核发育(in vitro gynogenesis，即未授粉子房——胚珠培养)以及原位雌核发育(in situparthenogenesis，即用化学试剂、辐射等处理过的花粉授粉诱导)等3种人工诱导途径获得单倍体植株。近30年来，国内外研究者在西瓜花粉培养方面做了一些探索研究并取得了初步成功，但由于各种离体诱导条件较难控制且再生植株倍性复杂等原因，高效、稳定的西瓜单倍体培养体系尚未成功建立，还未能有效应用于西瓜育种。
1 试验材料
1.1 基因型
供体植株的基因型是影响花药培养的关键因素。不同基因型植株花药对培养基反应是不同的。有些基因型的花药只对特定培养基有反应，有些材料甚至对某些培养基没有反应，还有些基因型的花药则对几种培养基均有反应。缑艳霞的试验结果表明3个F1代杂交品种中，春光和拿比特花药愈伤组织诱导率显著高于喜都。在李娟等的试验中发现，野生品种和栽培品种愈伤组织诱导率有显著差别，前者要高于后者。
1.2 小孢子发育时期
许多研究表明，花粉的发育阶段对诱导雄性单性生殖至关重要，是能否诱导成功及诱导频率高低的内在因素之一。这关系到是否能产生胚性愈伤组织，进而产生单倍体，也关系到培养条件及培养效果。在大多数作物花药培养中。花粉的发育时期选用的都是单核靠边期，但目前对其作用机理还不是很清楚。在黄瓜花药培养中，不同发育期的花药几乎同样能够形成愈伤组织。在谢淼等的试验中却认为单核中后期的花药作为外植体较适宜。而甜瓜花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期。1981年薛光荣利用琼酥西瓜品种，通过培养单核靠边期的花药在国际上首次获得了西瓜单倍体植株，并从其加倍后代中获得了新品种，但是并没有进行推广。在确定花粉发育时期时，不能仅凭花蕾大小来判断。因为花蕾大小因植株生长状况及采花时期不同，同样大小的花蕾发育时期也不尽相同。
1.3 材料生长环境
一般认为供体植株的生长环境条件对小孢子活力及培养效果有影响㈣。缑艳霞的试验说明，在小孢子形成初期整天阴雨连绵。会造成花粉败育，小孢子的活性就降低，花药愈伤组织诱导率低和植株再生率低，并且转移到分化培养基上也容易死亡。此外，光照和光周期也会影响到供体植株花药培养的胚诱导率、分化率及胚状体的形成。谢淼等的试验发现由于季节不同，所接种的黄瓜花药诱导率不同，春季比秋季的效果好。李娟等在西瓜花药和小孢子培养研究中说明适宜的生长条件。才更利于西瓜花药培养胚诱导和植株再生。
2 培养基成分
2.1 基本培养基
大多数瓜类花药培养都选用MS作基本培养基。也有选用其他培养基。谢淼等选用MS和B5作为基本培养基对黄瓜花药进行培养。在有关丝瓜花药培养的研究中选用的是N6。袁万良等在薛光荣的基础上，通过改良培养基解决了愈伤组织褐变死亡问题，将分化阶段愈伤组织的诱导率从0.5％提高到了94.4％，并快速诱导出了绿色组织。
2.2 生长调节剂
基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动。但只有配合使用适当的外源生长调节剂，才能诱导细胞分裂、愈伤组织生长以及芽、根的分化等。生长素和细胞分裂素在植物不同生长时期的需求配比有所变化，生长调节剂在不同组织培养中的协同作用也对瓜类花药组织培养有着显著影响。缑艳霞在西瓜花药培养中发现2.4－D在西瓜花药愈伤组织诱导中起着关键作用，但其质量浓度超过0.5mg／L时，易形成白化疏松的愈伤组织，没有分化能力：萘乙酸诱导愈伤组织的作用不强，但是愈伤组织的质量较好，有较高的分化潜力。
2.3 碳源
碳源是植物组织培养不可缺少的物质。它不仅能给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等。其中蔗糖能支持绝大多数植物离体培养物的旺盛生长，一直被认为是植物组织培养的标准碳源而被广泛应用。然而近年来。许多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物对不同糖类的反应不完全相同。并且多数植物组织培养物除蔗糖外。在葡萄糖、果糖为碳源时也能生长良好。碳源一般在6％～12％变化范围内即可满足瓜类植物营养需求。最近的研究发现，在诱导培养基中糖的类型和浓度可影响雄性单性生殖，不仅影响愈伤组织诱导率，而且还影响愈伤组织的质地和结构。在花药培养前期。高浓度的蔗糖不仅可诱导花粉胚的形成，而且由于花粉细胞的渗透压比体细胞的渗透压高，在一定浓度范围内能降低花丝等体细胞愈伤组织的发生，从而提高花粉愈伤组织发生的比例：在中后期，降低蔗糖浓度可提高培养基水势，促进单倍体细胞生长和繁殖，有利于愈伤组织和胚状体的发育和分化。
2.4 活性炭
加入活性炭的目的主要利用其吸附性，减少有害物质的不利影响，如活性炭能吸附一些酚类物质，可以减轻愈伤组织的褐化，吸收琼脂中的杂质等。此外，创造暗环境，有利于某些植物生根。但是活性炭也能吸收有益物质，如NAA。KT，6－BA，Fe－EDTA。对于不同材料，活性炭的效果可能不同。而在葫芦科作物上，喻财铃和缑艳霞分别在丝瓜和西瓜的试验中发现加入活性炭效果差，有抑制愈伤组织形成的作用。
2.5 硝酸银
硝酸银作为乙烯抑制剂，在组织及细胞培养中能够促进胚性愈伤组织的形成，并且能促进多胺的合成以提高胚性愈伤组织的形成，进而提高愈伤组 织分化频率。在葫芦科作物花药培养中，很少有关于硝酸银应用的报道。但在其他组织器官培养中有许多报道。曹利仙等发现在黄瓜离体子叶培养中添加2～6mg／L硝酸银能显著提高子叶芽的再生频率。韩丽华将硝酸银应用于厚皮甜瓜未受精胚珠的离体培养上，发现对诱导单倍体再生植株有一定的作用。
2.6 三十烷醇
三十烷醇在花药培养中的作用还不太清楚。但三十烷醇生理活性很强，使用浓度较低，具有促进生根、发芽等功用。许多人认为三十烷醇对培养基中的有害物质有一定抑制作用，可促进有效愈伤组织的形成。袁万良等㈣发现加入一定浓度的三十烷醇，愈伤组织全部变为绿色，并形成深绿色点状组织，提高了再生植株的诱导率。并且在李娟等H的试验研究中也发现三十烷醇有此作用，但在缑艳霞和王开冻等㈣的试验研究中发现三十烷醇只对诱导和保持绿色愈伤组织有利，对促进不定芽形成的作用则不明显。
3 花药处理方法
3.1 预处理
花药经过预处理后再进行培养是花药培养中比较常见的培养方法。其中包括低温、高温、热激、离心以及甘露醇处理等。大部分葫芦科作物花药培养采用低温对花药进行预处理，其作用是：(1)引起花药内源生长调节剂发生变化，进而影响愈伤组织的形成；(2)引起小孢子的孤立化，使花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中退化解体；(3)减缓小孢子退化，保持生活力，使更多的小孢子有机会参与雄核发育。魏瑛的研究表明西瓜花药在4℃下低温处理72h效果较佳；Ashok Kumar等将黄瓜花蕾在4、32℃下分别处理1～10d，结果表明在4℃下处理2d的效果最佳。
3.2 接种密度
接种密度与诱导率成正相关。接种密度不可过大，以尽量减少花药在空间和营养上的竞争和选择：但也不能过少，否则不利于促进物质的形成，也不利于愈伤组织的形成。西瓜花药培养通常在6cm的瓶中接种4个花蕾的20枚花药。
3.3 培养温度
花药培养中，培养温度对愈伤组织或胚状体的形成以及促进其生长都有重要作用。大部分葫芦科作物花药培养的温度为25～28℃。温度过高会导致某些种类花药的死亡。瓜类的花药培养温度比其他种类要高一些，白天温度一般为25～30℃，夜间则较低。在西瓜花药培养中，缑艳霞尝试了将花药在30℃下高温预处理72h后置于25℃低温下，发现也能提高愈伤组织的诱导率。
3.4 培养光照
在一些材料的培养过程中，暗培养可以促进愈伤组织的诱导。但试验表明，在对甜瓜花药进行培养时，长时间的黑暗将会使愈伤组织质量有所下降，而适当的光照反而有助于愈伤组织的生长。先黑暗培养后再进行光照培养，也能促进优良愈伤组织的诱导，这在甜瓜、丝瓜上都得到了验证。在西瓜上还尚未见明确的报道。
4
性鉴定技术
染色体计数法是确定倍性最基本和最精确的方法，通常是以根尖为材料，也可选择以卷须、叶片愈伤组织为材料，可以在组织培养早期检出倍性。再者，还可以利用扫描细胞光度仪、细胞学和形态学等间接手段进行鉴定。在西瓜子叶离体组织培养中利用西瓜单倍体、二倍体和四倍体对高温和低温的不同反应进行倍性鉴定。
5 色体加倍技术
单倍体植株如何加倍成为纯合的二倍体植株，对于将花药培养技术真正用于实际的育种工作至关重要。目前加倍的途径有2种：自然加倍和人工加倍。在瓜类作物单倍体育种中的单倍体自然加倍率很低，仅在西瓜上有过报道；人工加倍技术一般借鉴传统的西瓜、甜瓜整体诱导多倍体的方法——秋水仙碱浸泡法来处理单倍体植株，并无多大改进。目前，对于瓜类单倍体加倍的深入研究较少，并且仅局限在单倍体植株的离体加倍处理。Sari和Abak认为，与黄瓜相比，西瓜对秋水仙碱的敏感程度较低。因此通过加倍得到的西瓜双单倍体植株有正常的叶片、生长势和育性，自交能获得种子。
6 存在的问题及展望
虽然西瓜花药培养技术逐渐完善，但从前人的研究中可以看出，目前花药培养还存在不少问题。(1)由于药壁等体细胞的干扰，导致愈伤组织中细胞的倍性变化复杂且没有成熟的快速鉴定方法。(2)愈伤组织诱导率虽然得到了提高，但分化和再生能力低，小植株的诱导率很低。(3)培养途径单一，只是通过愈伤组织后再分化、生根。没有直接形成胚状体的研究等。
西瓜花药培养中出现的问题，基本都与生长调节剂种类及浓度相关。寻找合适的生长调节剂种类及浓度是解决西瓜花药培养的关键，并且要注重硝酸银和三十烷醇的应用。相信在不久的将来，西瓜花药培养技术能够逐步完善，为遗传育种做贡献。
关键词：西瓜；花药培养；基因型；培养基；碳源；生长调节剂；活性炭
西瓜(Citrullus lanatus)又称夏瓜、寒瓜，堪称瓜中之王。因在汉代从西域引入，故称西瓜。属葫芦科，西瓜属，一年生草本植物。与大多数作物相比，西瓜品种间同源性较高，遗传基础非常狭窄，所以，有必要拓宽西瓜的种质遗传基础，为遗传育种做贡献。单倍体尤其是双单倍体与分子生物学、基因工程、诱变育种相结合，可以加速育种进程，并能更好地改良西瓜遗传基础，产生更多的高抗优质高产品种，同时丰富品种的多样性。单倍体不存在显隐性问题，产生的隐性突变在第1代即可表现出来。其基因型完全可以由表现型反映出来，有利于鉴定和选择。再者，利用花药和花粉培养的胚状体或愈伤组织不仅可以作为基因工程的受体进行基因转化，而且可以快速获得符合育种目标的植株，提高育种效率。
在西瓜上自发产生单倍体的频率极低，为了获得西瓜单倍体。国内外研究者主要通过离体雄核发育(in vitro androgenesis，即花粉——小孢子培养)、离体雌核发育(in vitro gynogenesis，即未授粉子房——胚珠培养)以及原位雌核发育(in situparthenogenesis，即用化学试剂、辐射等处理过的花粉授粉诱导)等3种人工诱导途径获得单倍体植株。近30年来，国内外研究者在西瓜花粉培养方面做了一些探索研究并取得了初步成功，但由于各种离体诱导条件较难控制且再生植株倍性复杂等原因，高效、稳定的西瓜单倍体培养体系尚未成功建立，还未能有效应用于西瓜育种。
1 试验材料
1.1 基因型
供体植株的基因型是影响花药培养的关键因素。不同基因型植株花药对培养基反应是不同的。有些基因型的花药只对特定培养基有反应，有些材料甚至对某些培养基没有反应，还有些基因型的花药则对几种培养基均有反应。缑艳霞的试验结果表明3个F1代杂交品种中，春光和拿比特花药愈伤组织诱导率显著高于喜都。在李娟等的试验中发现，野生品种和栽培品种愈伤组织诱导率有显著差别，前者要高于后者。
1.2 小孢子发育时期
许多研究表明，花粉的发育阶段对诱导雄性单性生殖至关重要，是能否诱导成功及诱导频率高低的内在因素之一。这关系到是否能产生胚性愈伤组织，进而产生单倍体，也关系到培养条件及培养效果。在大多数作物花药培养中。花粉的发育时期选用的都是单核靠边期，但目前对其作用机理还不是很清楚。在黄瓜花药培养中，不同发育期的花药几乎同样能够形成愈伤组织。在谢淼等的试验中却认为单核中后期的花药作为外植体较适宜。而甜瓜花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期。1981年薛光荣利用琼酥西瓜品种，通过培养单核靠边期的花药在国际上首次获得了西瓜单倍体植株，并从其加倍后代中获得了新品种，但是并没有进行推广。在确定花粉发育时期时，不能仅凭花蕾大小来判断。因为花蕾大小因植株生长状况及采花时期不同，同样大小的花蕾发育时期也不尽相同。
1.3 材料生长环境
一般认为供体植株的生长环境条件对小孢子活力及培养效果有影响㈣。缑艳霞的试验说明，在小孢子形成初期整天阴雨连绵。会造成花粉败育，小孢子的活性就降低，花药愈伤组织诱导率低和植株再生率低，并且转移到分化培养基上也容易死亡。此外，光照和光周期也会影响到供体植株花药培养的胚诱导率、分化率及胚状体的形成。谢淼等的试验发现由于季节不同，所接种的黄瓜花药诱导率不同，春季比秋季的效果好。李娟等在西瓜花药和小孢子培养研究中说明适宜的生长条件。才更利于西瓜花药培养胚诱导和植株再生。
2 培养基成分
2.1 基本培养基
大多数瓜类花药培养都选用MS作基本培养基。也有选用其他培养基。谢淼等选用MS和B5作为基本培养基对黄瓜花药进行培养。在有关丝瓜花药培养的研究中选用的是N6。袁万良等在薛光荣的基础上，通过改良培养基解决了愈伤组织褐变死亡问题，将分化阶段愈伤组织的诱导率从0.5％提高到了94.4％，并快速诱导出了绿色组织。
2.2 生长调节剂
基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动。但只有配合使用适当的外源生长调节剂，才能诱导细胞分裂、愈伤组织生长以及芽、根的分化等。生长素和细胞分裂素在植物不同生长时期的需求配比有所变化，生长调节剂在不同组织培养中的协同作用也对瓜类花药组织培养有着显著影响。缑艳霞在西瓜花药培养中发现2.4－D在西瓜花药愈伤组织诱导中起着关键作用，但其质量浓度超过0.5mg／L时，易形成白化疏松的愈伤组织，没有分化能力：萘乙酸诱导愈伤组织的作用不强，但是愈伤组织的质量较好，有较高的分化潜力。
2.3 碳源
碳源是植物组织培养不可缺少的物质。它不仅能给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇等。其中蔗糖能支持绝大多数植物离体培养物的旺盛生长，一直被认为是植物组织培养的标准碳源而被广泛应用。然而近年来。许多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物对不同糖类的反应不完全相同。并且多数植物组织培养物除蔗糖外。在葡萄糖、果糖为碳源时也能生长良好。碳源一般在6％～12％变化范围内即可满足瓜类植物营养需求。最近的研究发现，在诱导培养基中糖的类型和浓度可影响雄性单性生殖，不仅影响愈伤组织诱导率，而且还影响愈伤组织的质地和结构。在花药培养前期。高浓度的蔗糖不仅可诱导花粉胚的形成，而且由于花粉细胞的渗透压比体细胞的渗透压高，在一定浓度范围内能降低花丝等体细胞愈伤组织的发生，从而提高花粉愈伤组织发生的比例：在中后期，降低蔗糖浓度可提高培养基水势，促进单倍体细胞生长和繁殖，有利于愈伤组织和胚状体的发育和分化。
2.4 活性炭
加入活性炭的目的主要利用其吸附性，减少有害物质的不利影响，如活性炭能吸附一些酚类物质，可以减轻愈伤组织的褐化，吸收琼脂中的杂质等。此外，创造暗环境，有利于某些植物生根。但是活性炭也能吸收有益物质，如NAA。KT，6－BA，Fe－EDTA。对于不同材料，活性炭的效果可能不同。而在葫芦科作物上，喻财铃和缑艳霞分别在丝瓜和西瓜的试验中发现加入活性炭效果差，有抑制愈伤组织形成的作用。
2.5 硝酸银
硝酸银作为乙烯抑制剂，在组织及细胞培养中能够促进胚性愈伤组织的形成，并且能促进多胺的合成以提高胚性愈伤组织的形成，进而提高愈伤组 织分化频率。在葫芦科作物花药培养中，很少有关于硝酸银应用的报道。但在其他组织器官培养中有许多报道。曹利仙等发现在黄瓜离体子叶培养中添加2～6mg／L硝酸银能显著提高子叶芽的再生频率。韩丽华将硝酸银应用于厚皮甜瓜未受精胚珠的离体培养上，发现对诱导单倍体再生植株有一定的作用。
2.6 三十烷醇
三十烷醇在花药培养中的作用还不太清楚。但三十烷醇生理活性很强，使用浓度较低，具有促进生根、发芽等功用。许多人认为三十烷醇对培养基中的有害物质有一定抑制作用，可促进有效愈伤组织的形成。袁万良等㈣发现加入一定浓度的三十烷醇，愈伤组织全部变为绿色，并形成深绿色点状组织，提高了再生植株的诱导率。并且在李娟等H的试验研究中也发现三十烷醇有此作用，但在缑艳霞和王开冻等㈣的试验研究中发现三十烷醇只对诱导和保持绿色愈伤组织有利，对促进不定芽形成的作用则不明显。
3 花药处理方法
3.1 预处理
花药经过预处理后再进行培养是花药培养中比较常见的培养方法。其中包括低温、高温、热激、离心以及甘露醇处理等。大部分葫芦科作物花药培养采用低温对花药进行预处理，其作用是：(1)引起花药内源生长调节剂发生变化，进而影响愈伤组织的形成；(2)引起小孢子的孤立化，使花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中退化解体；(3)减缓小孢子退化，保持生活力，使更多的小孢子有机会参与雄核发育。魏瑛的研究表明西瓜花药在4℃下低温处理72h效果较佳；Ashok Kumar等将黄瓜花蕾在4、32℃下分别处理1～10d，结果表明在4℃下处理2d的效果最佳。
3.2 接种密度
接种密度与诱导率成正相关。接种密度不可过大，以尽量减少花药在空间和营养上的竞争和选择：但也不能过少，否则不利于促进物质的形成，也不利于愈伤组织的形成。西瓜花药培养通常在6cm的瓶中接种4个花蕾的20枚花药。
3.3 培养温度
花药培养中，培养温度对愈伤组织或胚状体的形成以及促进其生长都有重要作用。大部分葫芦科作物花药培养的温度为25～28℃。温度过高会导致某些种类花药的死亡。瓜类的花药培养温度比其他种类要高一些，白天温度一般为25～30℃，夜间则较低。在西瓜花药培养中，缑艳霞尝试了将花药在30℃下高温预处理72h后置于25℃低温下，发现也能提高愈伤组织的诱导率。
3.4 培养光照
在一些材料的培养过程中，暗培养可以促进愈伤组织的诱导。但试验表明，在对甜瓜花药进行培养时，长时间的黑暗将会使愈伤组织质量有所下降，而适当的光照反而有助于愈伤组织的生长。先黑暗培养后再进行光照培养，也能促进优良愈伤组织的诱导，这在甜瓜、丝瓜上都得到了验证。在西瓜上还尚未见明确的报道。
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性鉴定技术
染色体计数法是确定倍性最基本和最精确的方法，通常是以根尖为材料，也可选择以卷须、叶片愈伤组织为材料，可以在组织培养早期检出倍性。再者，还可以利用扫描细胞光度仪、细胞学和形态学等间接手段进行鉴定。在西瓜子叶离体组织培养中利用西瓜单倍体、二倍体和四倍体对高温和低温的不同反应进行倍性鉴定。
5 色体加倍技术
单倍体植株如何加倍成为纯合的二倍体植株，对于将花药培养技术真正用于实际的育种工作至关重要。目前加倍的途径有2种：自然加倍和人工加倍。在瓜类作物单倍体育种中的单倍体自然加倍率很低，仅在西瓜上有过报道；人工加倍技术一般借鉴传统的西瓜、甜瓜整体诱导多倍体的方法——秋水仙碱浸泡法来处理单倍体植株，并无多大改进。目前，对于瓜类单倍体加倍的深入研究较少，并且仅局限在单倍体植株的离体加倍处理。Sari和Abak认为，与黄瓜相比，西瓜对秋水仙碱的敏感程度较低。因此通过加倍得到的西瓜双单倍体植株有正常的叶片、生长势和育性，自交能获得种子。
6 存在的问题及展望
虽然西瓜花药培养技术逐渐完善，但从前人的研究中可以看出，目前花药培养还存在不少问题。(1)由于药壁等体细胞的干扰，导致愈伤组织中细胞的倍性变化复杂且没有成熟的快速鉴定方法。(2)愈伤组织诱导率虽然得到了提高，但分化和再生能力低，小植株的诱导率很低。(3)培养途径单一，只是通过愈伤组织后再分化、生根。没有直接形成胚状体的研究等。
西瓜花药培养中出现的问题，基本都与生长调节剂种类及浓度相关。寻找合适的生长调节剂种类及浓度是解决西瓜花药培养的关键，并且要注重硝酸银和三十烷醇的应用。相信在不久的将来，西瓜花药培养技术能够逐步完善，为遗传育种做贡献。