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摘 要：本研究旨在研究不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排毒规律。选取SPF鸡进行H9N2灭活疫苗免疫，根据HI效价将鸡群分成高、中、低三组，攻毒后分析其排毒差异。结果发现：抗体水平为9.44 log2时，个别鸡只仍会感染排毒，且抗体水平越低，感染排毒鸡只数量越多;当抗体水平达到11 log2时，鸡群不再排毒。
关键词：禽流感病毒;H9亚型;不同免疫抗体水平;排毒规律
疫苗免疫是控制H9亚型AIV的有效措施[1]。但由于疫苗质量、免疫程序、营养、机体本身等各种因素易造成免疫失败，使AIV的发生呈现越来越多的非典型性，给诊断、预防带来极大困难[2，3]。同时，随着免疫压力的增加，H9亚型流感病毒出现了新的特征，高抗体水平条件下仍然出现H9亚型禽流感病毒感染，鸡胚接种试验发现H9亚型野外分离毒株的致病力明显增强[4，5]。因此，在对AIV流行株进行监测的同时，有必要对不同抗体水平状态下的鸡群感染H9后的排毒规律进行研究，从而对H9亚型AIV的科学防控具有重要指导意义。
1 材料与方法
1.1 毒株 H9亚型AIV：本实验室分离保存，命名为CJ1302。
1.2 试验动物及主要试剂 SPF鸡、10日龄SPF鸡胚，由山东昊泰实验动物繁育中心提供;10%的甘油PBS（含双抗10000 U/mL）;反转录酶（M-MLV），Promega公司产品;Trizol试剂，Invitrogen公司产品。
1.3 不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排毒规律研究 SPF鸡7 d时免疫H9N2灭活疫苗，肌肉注射，0.6 mL/只，带翅号;14 d时选取一部分鸡只进行二次免疫，定期进行H9抗体效价测定，根据HI效价将鸡群分成3组：HI效价为6～7 log2的确定为1组，即低抗体组（6.44 log2）;HI效价为8～10log2的确定为2组，即中抗体组（9.44 log2）;HI效价为11 log2的确定为3组，即高抗体组（11 log2），隔离器分开饲养。另设非免疫组作为对照组，每组9只。将H9亚型AIV毒株（CJ1302）作1：10稀释，每只1.0 mL点眼滴鼻。攻毒后每隔24 h采集一次泄殖腔棉拭子，连续采集10 d，将采集的棉拭子放入装有10%的甘油PBS（含双抗10000 U/ml）的离心管中，-80℃保存备用。
1.4 病毒分离及RT-PCR方法检测 将采集的棉拭子高速离心，取上清，接种10日龄SPF鸡胚，每管接种2枚，0.2 mL/枚，另设生理盐水对照。37 ℃温箱培养，观察4 d，记录结果，收取活胚尿囊液进行血凝试验， 同时进行常规RT-PCR方法复核检测。
1.5 分离毒HA基因测序分析 选取几个代表组不同时间点的分离毒及攻毒用毒株，进行HA基因的扩增、克隆及测序，进一步分析攻毒后不同时间的排毒在序列上的差异。
2 结果
2.1 不同HI抗体水平状态下H9亚型AIV的排毒情况分析 将病毒分离和RT-PCR检测均为阳性者判定为排毒，1组鸡群从第2天开始排毒，持续至第5天，6～7 d时不再排毒，但第8天又出现排毒。2组鸡群第2天时只有1只排毒，之后不再排毒，直到第9天时又出现鸡只排毒。3组没有排毒现象。详细结果见表1。
2.2 部分分离毒HA基因测序分析 为进一步分析上述排毒现象，选取2组感染H9亚型AIV 2 d（2组-2 d）和9 d（2组-9 d）以及对照组8 d（对照-8 d）泄殖腔棉拭子分离毒、攻毒用毒株，进行HA基因的扩增、克隆及测序分析。结果发现，2组免疫鸡群感染H9亚型AIV 2d和9d的分离毒两者HA基因的氨基酸序列相似性为98.5%，两者与攻毒株HA基因的氨基酸序列相似性分别为96.8%和97%（表2）。
3 讨论与分析
3.1 在普遍使用H9N2亚型禽流感灭活疫苗的强大免疫压力下，H9N2病毒变异加快，出现了多个基因亚型的H9N2亚型禽流感流行毒株，虽然H9N2 亚型AIV发生了一定变异，现有疫苗已不能提供完全保护，除考虑流行毒株外，应制定合理的免疫程序，这就需要定期进行抗体监测和评估，本试验就是为探讨不同抗体水平下H9的排毒情况，进而确定抗体水平与免疫保护之间的关系。
3.2 从表1和表2可以看出，抗体水平为6.44 log2的试验鸡排毒数量多、持续时间长，表明该抗体水平不能有效抵抗H9亚型AIV的攻击。抗体水平达到11 log2时，鸡群泄殖腔中未分离到病毒，表明鸡群不再排毒。抗体水平为9.44 log2时，鸡群攻毒后2 d时只有一只鸡泄殖腔能分离到病毒，而9 d时又出现一只鸡泄殖腔分离到病毒。为进一步确定攻毒后9 d时分离毒的来源，我们对这两个时间点的病毒进行了HA基因测序分析，两者氨基酸序列相似性高达98.5%，表明9 d排毒鸡只可能又被同一鸡群中排毒鸡只感染所致。因此，实际生产过程中应定期进行流行毒株的抗体监测，尽量保证鸡群处于高抗体水平，才能有效抵御疾病风险。
参考文献：
[1] 陈银.耐热新城疫病毒载体的构建及其在H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用[D].扬州：扬州大学，2019.
[2] 余文兰，梁柏，刘郁夫，等.H9N2亚型AIV不同攻毒方式排毒规律的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（22）：126-128.
[3] 李家凯，郭康康，刘丽娜，等.肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查[J].湖北农业科学，2020，59（11）：104-106.
[4] 张伟.1999年～2013年山東鸡源H9N2亚型禽流感病毒遗传演化和血凝素抗原性研究[D].北京：中国农业大学，2015.
[5] 李悦.山东规模化鸡场H9N2亚型禽流感流行病学调查及流行毒株分子生物学特征分析[D].泰安：山东农业大学，2020.
关键词：禽流感病毒;H9亚型;不同免疫抗体水平;排毒规律
疫苗免疫是控制H9亚型AIV的有效措施[1]。但由于疫苗质量、免疫程序、营养、机体本身等各种因素易造成免疫失败，使AIV的发生呈现越来越多的非典型性，给诊断、预防带来极大困难[2，3]。同时，随着免疫压力的增加，H9亚型流感病毒出现了新的特征，高抗体水平条件下仍然出现H9亚型禽流感病毒感染，鸡胚接种试验发现H9亚型野外分离毒株的致病力明显增强[4，5]。因此，在对AIV流行株进行监测的同时，有必要对不同抗体水平状态下的鸡群感染H9后的排毒规律进行研究，从而对H9亚型AIV的科学防控具有重要指导意义。
1 材料与方法
1.1 毒株 H9亚型AIV：本实验室分离保存，命名为CJ1302。
1.2 试验动物及主要试剂 SPF鸡、10日龄SPF鸡胚，由山东昊泰实验动物繁育中心提供;10%的甘油PBS（含双抗10000 U/mL）;反转录酶（M-MLV），Promega公司产品;Trizol试剂，Invitrogen公司产品。
1.3 不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排毒规律研究 SPF鸡7 d时免疫H9N2灭活疫苗，肌肉注射，0.6 mL/只，带翅号;14 d时选取一部分鸡只进行二次免疫，定期进行H9抗体效价测定，根据HI效价将鸡群分成3组：HI效价为6～7 log2的确定为1组，即低抗体组（6.44 log2）;HI效价为8～10log2的确定为2组，即中抗体组（9.44 log2）;HI效价为11 log2的确定为3组，即高抗体组（11 log2），隔离器分开饲养。另设非免疫组作为对照组，每组9只。将H9亚型AIV毒株（CJ1302）作1：10稀释，每只1.0 mL点眼滴鼻。攻毒后每隔24 h采集一次泄殖腔棉拭子，连续采集10 d，将采集的棉拭子放入装有10%的甘油PBS（含双抗10000 U/ml）的离心管中，-80℃保存备用。
1.4 病毒分离及RT-PCR方法检测 将采集的棉拭子高速离心，取上清，接种10日龄SPF鸡胚，每管接种2枚，0.2 mL/枚，另设生理盐水对照。37 ℃温箱培养，观察4 d，记录结果，收取活胚尿囊液进行血凝试验， 同时进行常规RT-PCR方法复核检测。
1.5 分离毒HA基因测序分析 选取几个代表组不同时间点的分离毒及攻毒用毒株，进行HA基因的扩增、克隆及测序，进一步分析攻毒后不同时间的排毒在序列上的差异。
2 结果
2.1 不同HI抗体水平状态下H9亚型AIV的排毒情况分析 将病毒分离和RT-PCR检测均为阳性者判定为排毒，1组鸡群从第2天开始排毒，持续至第5天，6～7 d时不再排毒，但第8天又出现排毒。2组鸡群第2天时只有1只排毒，之后不再排毒，直到第9天时又出现鸡只排毒。3组没有排毒现象。详细结果见表1。
2.2 部分分离毒HA基因测序分析 为进一步分析上述排毒现象，选取2组感染H9亚型AIV 2 d（2组-2 d）和9 d（2组-9 d）以及对照组8 d（对照-8 d）泄殖腔棉拭子分离毒、攻毒用毒株，进行HA基因的扩增、克隆及测序分析。结果发现，2组免疫鸡群感染H9亚型AIV 2d和9d的分离毒两者HA基因的氨基酸序列相似性为98.5%，两者与攻毒株HA基因的氨基酸序列相似性分别为96.8%和97%（表2）。
3 讨论与分析
3.1 在普遍使用H9N2亚型禽流感灭活疫苗的强大免疫压力下，H9N2病毒变异加快，出现了多个基因亚型的H9N2亚型禽流感流行毒株，虽然H9N2 亚型AIV发生了一定变异，现有疫苗已不能提供完全保护，除考虑流行毒株外，应制定合理的免疫程序，这就需要定期进行抗体监测和评估，本试验就是为探讨不同抗体水平下H9的排毒情况，进而确定抗体水平与免疫保护之间的关系。
3.2 从表1和表2可以看出，抗体水平为6.44 log2的试验鸡排毒数量多、持续时间长，表明该抗体水平不能有效抵抗H9亚型AIV的攻击。抗体水平达到11 log2时，鸡群泄殖腔中未分离到病毒，表明鸡群不再排毒。抗体水平为9.44 log2时，鸡群攻毒后2 d时只有一只鸡泄殖腔能分离到病毒，而9 d时又出现一只鸡泄殖腔分离到病毒。为进一步确定攻毒后9 d时分离毒的来源，我们对这两个时间点的病毒进行了HA基因测序分析，两者氨基酸序列相似性高达98.5%，表明9 d排毒鸡只可能又被同一鸡群中排毒鸡只感染所致。因此，实际生产过程中应定期进行流行毒株的抗体监测，尽量保证鸡群处于高抗体水平，才能有效抵御疾病风险。
参考文献：
[1] 陈银.耐热新城疫病毒载体的构建及其在H9N2亚型禽流感疫苗研制中的应用[D].扬州：扬州大学，2019.
[2] 余文兰，梁柏，刘郁夫，等.H9N2亚型AIV不同攻毒方式排毒规律的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（22）：126-128.
[3] 李家凯，郭康康，刘丽娜，等.肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查[J].湖北农业科学，2020，59（11）：104-106.
[4] 张伟.1999年～2013年山東鸡源H9N2亚型禽流感病毒遗传演化和血凝素抗原性研究[D].北京：中国农业大学，2015.
[5] 李悦.山东规模化鸡场H9N2亚型禽流感流行病学调查及流行毒株分子生物学特征分析[D].泰安：山东农业大学，2020.