【摘 要】
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本研究旨在建立对肠道主要共生菌的快速定量方法。根据细菌16SrRNA基因的保守序列并参考相关研究，设计针对总肠道菌群的通用引物和探针，以及针对双歧杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科的特异性引物和探针，采用引物设计工具（Primer-BLAST）以及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增以验证引物和探针的特异性。通过分子克隆技术，构建各目标菌属目的基因的重组质粒作为
【机 构】
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复旦大学基础医学院教育部医学分子病毒学重点实验室
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFC2000500/03）；
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本研究旨在建立对肠道主要共生菌的快速定量方法。根据细菌16SrRNA基因的保守序列并参考相关研究，设计针对总肠道菌群的通用引物和探针，以及针对双歧杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科的特异性引物和探针，采用引物设计工具（Primer-BLAST）以及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增以验证引物和探针的特异性。通过分子克隆技术，构建各目标菌属目的基因的重组质粒作为qPCR检测的标准模板，选择标准模板进行重复性实验，并计算组内和组间重复变异系数。用所建立的方法对不同年龄段的临床粪便标本进行3类细菌的检测，并初步分析这些菌群与增龄的关系。结果显示，引物和探针具有较高的特异性；各目的细菌标准曲线在一定范围内线性关系良好，总菌群或各目标菌属的线性范围分别为：总菌群2.9×10~3～2.9×1012copies/μL、双歧杆菌3.1×10~2～3.1×10~9 copies/μL、肠球菌5.9×10~2～5.9×10~9copies/μL、肠杆菌6.3×10~2～6.3×10~9 copies/μL，决定系数R~2≥0.995；检测的最低拷贝数为总菌群7.5×10~2 copies/μL、双歧杆菌46copies/μL、肠球菌37copies/μL、肠杆菌51copies/μL；重复性实验变异系数在1.32%以下，具有良好的可重复性。对不同年龄段临床粪便标本检测的结果显示，肠球菌和肠杆菌含量随增龄呈增长趋势，且老年组含量显著高于青年组，但在高龄老年人中未发现肠球菌数量增加。双歧杆菌含量随增龄减少，且各组间差异显著，在高龄老年人中也未观察到双歧杆菌显著减少。结果提示，本研究建立了一种可供临床推广的菌群绝对定量方法，能够同时检测3类细菌和菌群总量，对于菌群定量研究具有实际意义。
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