【摘 要】
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2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产.文中结合代谢工程和辅
【机 构】
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江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122
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2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产.文中结合代谢工程和辅因子工程策略设计高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的全细胞催化剂,实现微生物转化法合成2,5-DMP.本研究首先分析了不同微生物来源的苏氨酸脱氢酶(Threonine dehydrogenase,TDH)对2,5-DMP合成的影响,发现来源于大肠杆菌Escherichiacoli中EcTDH具有最佳的催化能力,2,5-DMP产量达到(438.3±23.7)mg/L.随后结合辅因子工程,通过引入乳脂链球菌Lactococcuscremoris中NADH氧化酶(NADH oxidase,LcNoxE)并优化其表达方式发现通过融合表达EcTDH和LcNoxE可平衡胞内NADH/NAD+水平,维持较高细胞存活率,进一步提高2,5-DMP产量.最后,通过阻断合成2,5-DMP的支路代谢途径,可以显著减少副产物积累,增加2,5-DMP产量,同时提高L-苏氨酸转化率.最终获得的重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHECNoxELC-PSstT在含有5 g/L L-苏氨酸的转化体系中于37 ℃、200 r/min孵化24 h,可积累(1 095.7±81.3)mg/L的2,5-DMP,L-苏氨酸转化率达到76％,产物得率为0.288 g/(gL-苏氨酸).因此,文中构建的重组菌可以实现高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP,具有一定的工业应用潜力.
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