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3.安徽中医药大学神经病学研究所，安徽 合肥 230061；4.安徽中医药大学中医临床学院，安徽 合肥 230038
摘要：目的 通过检测全基因组拷贝数变异（CNV）探究阳虚质的遗传机制。方法 按照《中医体质分类与判定》标准纳入阳虚质与平和质受试者各30例，提取外周血白细胞DNA，采用SNP6.0基因分型芯片进行全基因组关联分析，采用PennyCNV软件分析单个样本CNVs，逐个常染色体鉴定阳虚质特异的拷贝数变异区域（CNVR），通过人类基因组浏览器检索CNVR的相关基因及其注释。结果 平和质组平均CNV数为12.63±3.39，最小值为8，最大值为20；去掉2个异常值后，阳虚质组平均CNV数为15.04±8.95，最小值为2，最大值为38。从28个阳虚质样本中共鉴定出26个CNVR，其中有19个增加型CNVR、6个删除型CNVR、1个混合型CNVR。大多数CNVR仅被少数阳虚质受试者共享，仅7个CNVR被不少于5个阳虚质受试者共享。阳虚质特异的CNVR所包含的代表基因功能涉及细胞内外信号转导、代谢调节、免疫反应等。结论 阳虚质者基因组存在一些特异的CNVs，这些CNVs可能通过影响细胞内外信号转导、物质代谢（能量代谢）、免疫反应等相关基因的表达而导致阳虚质“表型”。
关键词：阳虚质；遗传机制；拷贝数变异
基金项目：国家自然科学基金（81072715）
阳虚质是阳气不足、以虚寒现象为主要特征的体质状态，即“阴盛之体”（《温热论》）、“素有寒者”（《伤寒总病论》）。阳虚质影响发病倾向性以及发病后的证候从化，形成“阳虚阴盛之疾”（《伤寒总病论·叙论》）。体质是人体生命过程中，在先天禀赋和后天获得的基础上所形成的形态结构、生理功能和心理状态方面综合的、相对稳定的固有特质[1]。受孕时父母体弱或肾精不足、天癸不足、命火不足，或孕母过食寒凉食品或过服寒凉药品可致子代阳虚质；出生后过食寒凉食品、过服寒凉药品、疾病影响也可导致阳虚质[2]。笔者认为，阳虚质表型是由多基因共同决定的，因此，很难从单个基因水平探究阳虚质的遗传机制，采用高通量基因分型芯片从基因组水平筛选阳虚质的遗传标记是目前最佳的研究切入点。单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和拷贝数变异（copy number variation，CNV）均是第3代遗传标记，其中CNV是通过改变基因量、打断编码序列及影响邻近基因的调节而影响基因表达和表型，对相当一部分人类表型变异（包括疾病易感性）存在影响[3-7]。本研究采用Affymetrix SNP 6.0芯片探测阳虚质者基因组的CNVs，旨在从全基因组水平阐明阳虚质的遗传学机制。
1 临床资料
1.1 纳入标准
①知情同意；②年龄18～45岁；③近1年来未患疾病，且未患影响工作和生活的慢性疾病；④平和质标准分≥60分，且任一偏颇体质标准分<30分；阳虚质标准分≥40分，或以阳虚质为主，且阳虚质标准分较其他体质标准分>15分者。
1.2 排除标准
①不符合纳入标准；②符合明显阳虚证者；③有精神疾患者；④有器质性病变、传染病、发热者。
1.3 受试者一般情况
于2010年11月-2011年4月，采用《中医体质量表》[8]进行了974例中医体质类型的流行病学调查[9]，按照《中医体质分类与判定》标准[10]，分别纳入平和质和阳虚质各30例。平和质男14例，女16例；年龄18～27例，平均（20.93±1.80）岁；均为高校学生。阳虚质男14例，女16例；年龄19～39岁，平均（22.83±4.74岁）；其中28例为高校学生，1例为事业单位工作人员，1例为商业服务人员。2组年龄比较，差异有统计学意义（P=0.045）；2组性别比较，差异无统计学意义（P=1.00）。
2 方法
2.1 标本采集
抽血前1日嘱受试者不饮酒，避免过累，女性避开月经期。于上午7：00-9：00采集静脉血2 mL，肝素抗凝，按Qiagen DNA提取试剂盒（德国产）说明书提取外周血白细胞DNA，-20 ℃保存于TRIzol（美国Invitrogen）中，1周内送至北京博奥生物技术有限公司对所提取的DNA进行质量检测。Affymetrix SNP 6.0平台基因组DNA质量测检报告提示，60份样本DNA均符合SNP 6.0基因分型芯片检测的要求（DNA无降解，主要条带清晰，DNA浓度≥50 ?g/?L，DNA总量≥1 ?g，A260/280值≥1.6且≤2.1）。
2.2 单个核苷酸多态性基因分型
由北京博奥生物有限公司按照《Affymetrix?全基因组人类SNP Nsp/Sty 6.0使用手册》进行SNP基因分型检测，得到原始的基因分型数据（CEL文件）。
步骤1：在Linux Ubuntu操作系统中，运用Birdseed算法，采用APT（Affymetrix power tools）软件从原始CEL文件读取SNP基因分型信号值。
步骤2：采用PennyCNV软件，从CEL文件提取每个SNP的A、B等位基因的信号强度值，对这些信号值进行分位数归一化处理。
步骤3：采用PennCNV软件包中的normalize_affy_geno_ cluster.pl程序计算每个样本每个SNP的R比值的对数值（Log R ratio，LRR）和B等位基因频率（B allele frequency， BAF），生成baf文件。
步骤4：采用PennCNV的kcolumn.pl程序，将庞大的baf文件拆分成单个样本的信号强度值，每个样本生成一个名为signallistfile的文本文件，再采用PennCNV软件的detect_cnv.pl程序检测每个样本的CNV。 步骤5：参照文献[6]确定CNV状态，见表1。
步骤6：CNV区域（copy number variation region，CNVR）、单例CNV、非单例CNV的界定：对每个阳虚质及平和质样本的CNV数进行统计，鉴定阳虚质特异的CNVR。CNVR是多个CNV的重叠区域，若2个以上阳虚质受试者的CNV重叠，就以2个CNV中距离最大的SNP作为边界将其合并成1个CNVR，当下一样本的CNV与上面CNVR重叠且边界超过时，新的CNVR的边界相应扩展，即1个CNVR是边界重叠的CNV的组合[11]。如chr10：133684252-135054190、chr10：134930114-135356694合并成1个CNVR，即chr10：133684252-135356694。存在任何数量重叠且在2个以上受试者中发现的CNVs称为非单例CNVs，而仅在1个受试者中测得的CNV称为单例CNV[3]。
3 结果
3.1 拷贝数变异分布
平和质组平均CNV数为12.63±3.39，最小值为8，最大值为20；阳虚质组平均CNV数为14.94±6.88，最小值为2，最大值为100，按单个样本CNV数超过“均数±3倍标准差”逐步剔除异常值16号和11号样本（CNV数分别为100、53，后续分析均剔除这2个样本），去掉2个异常值后阳虚质平均CNV数为15.04±8.95，最小值为2，最大值为38。2组CNV数比较，差异无统计学意义（P方差不齐，双侧=0.191）。平和质和阳虚质CNV、CNVR在常染色体的分布情况见表2。
3.2 拷贝数变异长度
去掉异常值后阳虚质组平均每个CNV的长度为692.48 kb，最小值1.13 kb，最大值6.21 Mb，中位数4.00 Mb，平均每个样本CNV总长度为10.41 Mb；平和质组平均每个CNV长度为915.93 kb，最小值1.61 kb，最大值29.94 Mb，中位数2.62 Mb，平均每个样本CNV总长度为11.57 Mb。
3.3 阳虚质拷贝数变异区域分布
阳虚质组状态1、状态2、状态5、状态6的CNV数分别为17、77、273、54；平和质组状态1、状态2、状态5、状态6的CNV数分别为16、70、222、71。
从28个阳虚质样本中共检测出26个CNVR，其中有19个增加型CNVR，6个删除型CNVR，1个混合型CNVR（既有删除型CNV又有增加型CNV）。大多数CNVR仅被少数阳虚质受试者共享，仅7个CNVR被不少于5个阳虚质的受试者共享。见表3。
3.4 拷贝数变异区域相关基因
在人类基因组浏览器中，共有11个CNVR含有可能的基因，且这些基因在基因本体（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）或BioCarta基因数据库中存在注释。这些CNVR及其可能包含的基因见表4。
4 讨论
常用的免费CNV分析软件有Affymetrix Power Tools （APT）、Aroma.Affymetrix、PennCNV和CRLMM，均可从Affymetrix 6.0 SNP微阵列平台获取。Affymetrix公司的SNP 6.0微阵列芯片有180万个基因标记，包括90.66万个SNPs和94.6万个CNV探针。PennCNV采用HapMap样本作为参照样本计算Log2（R比值），R为整个实验A、B等位基因标准化信号强度值之和，R比值=R观察/R理论[6]，而Aroma.Affymetrix和APT采用手头的数据作为参照数据，CRLMM采用线性模型评估绝对拷贝数，因此不需要参照样本，CRLMM至少需要10个样本以获得准确的模型参数，PennCNV和APT没有校正背景杂交。仅PennCNV提供CNV特有的质量控制指标以用于潜在的CNV过少的样本。PennCNV有利于分析位点水平的拷贝数，有利于在单一软件包内评估CNV特有的质量控制指标，PennCNV具有相对较小的偏倚和变异，在与CRLMM具有相似假阳性率时可以检测更多的CNVR[12]。PennCNV软件由于具有良好的分析效能且可免费获取，故被用于本研究的CNV分析。
本研究共入组30例阳虚质，其中被剔除的2个样本被认为不是来自阳虚质正态总体，没有进入后续的分析。28个阳虚质样本共鉴定出421个CNVs，其中74个CNVs仅见于单个阳虚质受试者，故未对这些CNVs可能包含的基因进行检索和注释。共鉴定出92个CNVR，其中67个CNVR也见于平和质受试者，经Fisher精确概率χ2检验，仅1个CNVR被阳虚质共享的例数显著多于被平和质共享的例数（P=0.047），故共对26个CNVR可能包含的基因进行了检索和注释。大多数CNVR被少数阳虚质受试者共享，少数CNVR虽被较多的阳虚质受试者共享，但其包含很少的基因，而且，这些基因在GO、KEGG、BioCarta数据库中无相关注释或仅有少量注释。有些CNVR虽包含较多的基因及其注释，但仅被2～3个阳虚质受试者共享。还有一些CNVR未包含可能的基因，这些CNVR也许位于DNA的非基因编码区，因为人类染色体中编码基因的碱基对数量占整个DNA碱基对总数的比例低于2%。
按GO、KEGG和BioCarta注释，阳虚质特异的CNVR所包含代表基因的功能可以分为几类：一为细胞内外信号转导，如G蛋白偶联信号通路、GTP结合、三磷酸肌醇信号通路、胰岛素信号通路、丝裂原活化的蛋白激酶信号通路均为人体内重要的信号通路，这些通路上编码某些蛋白的基因异常会导致相应表达产物的异常，从而对某些生理功能产生重要影响。二为代谢调节，如组氨酸代谢、氧化还原酶活性、药物代谢、脂肪酸代谢、脂质代谢过程、前体代谢产物和能量的生成、类固醇生物合成代谢，编码这些代谢调节因子的基因异常，也许会导致脂肪代谢异常，从而影响能量的产生而出现不耐寒冷的表现。三是与免疫反应有关，如T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路，这些受体信号通路上相关调节因子的编码基因异常，也许会影响T细胞和B细胞的功能，从而导致阳虚质者免疫功能的异常而易于感冒。 目前采用SNP基因分型芯片研究中医体质和证候的研究罕见报道。Liu等[13]采用家系研究的方法，观察了11个家族性肾阳虚者基因组的CNVs，结果显示肾阳虚者基因组CNVs的两侧基因可以分为几类，其中删除型CNVs两侧基因的生物学通路可分为结合与转运、细胞周期、信号转导及免疫反应，而增加型CNVs两侧基因的生物学通路可分为结合与转运、生物发生、神经系统发育、代谢调节及免疫反应，即肾阳虚者的代谢、生物起源、发育、信号转导和免疫反应等重要的生理功能减退。Liu等研究的受试对象为家族性肾阳虚者，与中医阳虚体质具有类似的形寒肢冷表现，所采用的芯片为Affymetrix 100 K芯片，采用Affymetrix的CNAT4.0软件分析CNVs。本研究与该研究具有一定的可比性，在CNVs所含基因的生物学注释上也具有一定的相似性。
总之，本研究采用SNP6.0基因 分型芯片对阳虚质者基因组的CNVs进行了检测，共鉴定出26个阳虚质特异的CNVR，这些CNVR可能含有一些与信号转导、物质代谢（能量代谢）、免疫反应相关的基因。由于拷贝数的删除或增加，会影响这些基因的剂量，从而导致相应表达产物数量的变化，最终形成某些阳虚质“性状”。本研究结果显示，禀赋遗传是阳虚质的主要成因，阳虚质者存在基因组结构基因的变异，阳虚质特征不是由单个基因决定的。由于本研究的样本量少，且很少类似研究可资借鉴，故本研究的主要意义在于方法的尝试，及阳虚质基因组CNVs的初步揭示，所得结果尚需大样本及家系研究的进一步确认。
参考文献：
[1] 王琦，郑守曾，项平，等.中医体质学[M].北京：人民卫生出版社，2005：2.
[2] 姚实林，王琦.阳虚质成因论析[J].中国中医基础医学杂志，2008， 14（6）：405-407.
[3] Lou H， Li S， Yang Y， et al. A map of copy number variations in Chinese populations[J]. PLoS One，2011，6（11）：e27341.
[4] Gao XL， Huang J. A robust penalized method for the analysis of noisy DNA copy number data[J]. BMC Genomics，2010，11：517.
[5] Jiang L， Jiang J， Wang J， et al. Genome-wide identification of copy number variations in Chinese Holstein[J]. PLoS One，2012， 7（11）：e48732.
[6] Wang K， Li M， Hadley D， et al. PennCNV：an integrated hidden Markov model designed for high-resolution copy number variation detection in whole-genome SNP genotyping data[J]. Genome Res， 2007，17（11）：1665-1674.
[7] Lin CH， Li LH， Ho SF， et al. A large-scale survey of genetic copy number variations among Han Chinese residing in Taiwan[J]. BMC Genet，2008，9：92.
[8] 朱燕波，王琦，陈柯帆，等.8448例一般人群的中医体质类型与健康状况关系的分层分析[J].中西医结合学报，2011，9（4）：382-389.
[9] 姚实林，张祖志，杨新胜，等.基于974例调查数据的中医兼夹体质分析[J].中西医结合学报，2012，10（5）：508-515.
[10] 中华中医药学会.中医体质分类与判定[M].北京：中国中医药出版社，2009.
[11] Sha BY， Yang TL， Zhao LJ， et al. Genome-wide association study suggested copy number variation may be associated with body mass index in the Chinese population[J]. J Hum Genet，2009，54（4）：199.
[12] Eckel-Passow JE， Atkinson EJ， Maharjan S， et al. Software comparison for evaluating genomic copy number variation for Affymetrix 6.0 SNP array platform[J]. BMC Bioinformatics，2011，12：220.
[13] Liu WW， Gao YX， Zhou LP， et al. Observations on copy number variations in a kidney-yang deficiency syndrome family[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2011，2011：ID 548358.
（收稿日期：2013-05-12，编辑：陈静）
摘要：目的 通过检测全基因组拷贝数变异（CNV）探究阳虚质的遗传机制。方法 按照《中医体质分类与判定》标准纳入阳虚质与平和质受试者各30例，提取外周血白细胞DNA，采用SNP6.0基因分型芯片进行全基因组关联分析，采用PennyCNV软件分析单个样本CNVs，逐个常染色体鉴定阳虚质特异的拷贝数变异区域（CNVR），通过人类基因组浏览器检索CNVR的相关基因及其注释。结果 平和质组平均CNV数为12.63±3.39，最小值为8，最大值为20；去掉2个异常值后，阳虚质组平均CNV数为15.04±8.95，最小值为2，最大值为38。从28个阳虚质样本中共鉴定出26个CNVR，其中有19个增加型CNVR、6个删除型CNVR、1个混合型CNVR。大多数CNVR仅被少数阳虚质受试者共享，仅7个CNVR被不少于5个阳虚质受试者共享。阳虚质特异的CNVR所包含的代表基因功能涉及细胞内外信号转导、代谢调节、免疫反应等。结论 阳虚质者基因组存在一些特异的CNVs，这些CNVs可能通过影响细胞内外信号转导、物质代谢（能量代谢）、免疫反应等相关基因的表达而导致阳虚质“表型”。
关键词：阳虚质；遗传机制；拷贝数变异
基金项目：国家自然科学基金（81072715）
阳虚质是阳气不足、以虚寒现象为主要特征的体质状态，即“阴盛之体”（《温热论》）、“素有寒者”（《伤寒总病论》）。阳虚质影响发病倾向性以及发病后的证候从化，形成“阳虚阴盛之疾”（《伤寒总病论·叙论》）。体质是人体生命过程中，在先天禀赋和后天获得的基础上所形成的形态结构、生理功能和心理状态方面综合的、相对稳定的固有特质[1]。受孕时父母体弱或肾精不足、天癸不足、命火不足，或孕母过食寒凉食品或过服寒凉药品可致子代阳虚质；出生后过食寒凉食品、过服寒凉药品、疾病影响也可导致阳虚质[2]。笔者认为，阳虚质表型是由多基因共同决定的，因此，很难从单个基因水平探究阳虚质的遗传机制，采用高通量基因分型芯片从基因组水平筛选阳虚质的遗传标记是目前最佳的研究切入点。单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和拷贝数变异（copy number variation，CNV）均是第3代遗传标记，其中CNV是通过改变基因量、打断编码序列及影响邻近基因的调节而影响基因表达和表型，对相当一部分人类表型变异（包括疾病易感性）存在影响[3-7]。本研究采用Affymetrix SNP 6.0芯片探测阳虚质者基因组的CNVs，旨在从全基因组水平阐明阳虚质的遗传学机制。
1 临床资料
1.1 纳入标准
①知情同意；②年龄18～45岁；③近1年来未患疾病，且未患影响工作和生活的慢性疾病；④平和质标准分≥60分，且任一偏颇体质标准分<30分；阳虚质标准分≥40分，或以阳虚质为主，且阳虚质标准分较其他体质标准分>15分者。
1.2 排除标准
①不符合纳入标准；②符合明显阳虚证者；③有精神疾患者；④有器质性病变、传染病、发热者。
1.3 受试者一般情况
于2010年11月-2011年4月，采用《中医体质量表》[8]进行了974例中医体质类型的流行病学调查[9]，按照《中医体质分类与判定》标准[10]，分别纳入平和质和阳虚质各30例。平和质男14例，女16例；年龄18～27例，平均（20.93±1.80）岁；均为高校学生。阳虚质男14例，女16例；年龄19～39岁，平均（22.83±4.74岁）；其中28例为高校学生，1例为事业单位工作人员，1例为商业服务人员。2组年龄比较，差异有统计学意义（P=0.045）；2组性别比较，差异无统计学意义（P=1.00）。
2 方法
2.1 标本采集
抽血前1日嘱受试者不饮酒，避免过累，女性避开月经期。于上午7：00-9：00采集静脉血2 mL，肝素抗凝，按Qiagen DNA提取试剂盒（德国产）说明书提取外周血白细胞DNA，-20 ℃保存于TRIzol（美国Invitrogen）中，1周内送至北京博奥生物技术有限公司对所提取的DNA进行质量检测。Affymetrix SNP 6.0平台基因组DNA质量测检报告提示，60份样本DNA均符合SNP 6.0基因分型芯片检测的要求（DNA无降解，主要条带清晰，DNA浓度≥50 ?g/?L，DNA总量≥1 ?g，A260/280值≥1.6且≤2.1）。
2.2 单个核苷酸多态性基因分型
由北京博奥生物有限公司按照《Affymetrix?全基因组人类SNP Nsp/Sty 6.0使用手册》进行SNP基因分型检测，得到原始的基因分型数据（CEL文件）。
步骤1：在Linux Ubuntu操作系统中，运用Birdseed算法，采用APT（Affymetrix power tools）软件从原始CEL文件读取SNP基因分型信号值。
步骤2：采用PennyCNV软件，从CEL文件提取每个SNP的A、B等位基因的信号强度值，对这些信号值进行分位数归一化处理。
步骤3：采用PennCNV软件包中的normalize_affy_geno_ cluster.pl程序计算每个样本每个SNP的R比值的对数值（Log R ratio，LRR）和B等位基因频率（B allele frequency， BAF），生成baf文件。
步骤4：采用PennCNV的kcolumn.pl程序，将庞大的baf文件拆分成单个样本的信号强度值，每个样本生成一个名为signallistfile的文本文件，再采用PennCNV软件的detect_cnv.pl程序检测每个样本的CNV。 步骤5：参照文献[6]确定CNV状态，见表1。
步骤6：CNV区域（copy number variation region，CNVR）、单例CNV、非单例CNV的界定：对每个阳虚质及平和质样本的CNV数进行统计，鉴定阳虚质特异的CNVR。CNVR是多个CNV的重叠区域，若2个以上阳虚质受试者的CNV重叠，就以2个CNV中距离最大的SNP作为边界将其合并成1个CNVR，当下一样本的CNV与上面CNVR重叠且边界超过时，新的CNVR的边界相应扩展，即1个CNVR是边界重叠的CNV的组合[11]。如chr10：133684252-135054190、chr10：134930114-135356694合并成1个CNVR，即chr10：133684252-135356694。存在任何数量重叠且在2个以上受试者中发现的CNVs称为非单例CNVs，而仅在1个受试者中测得的CNV称为单例CNV[3]。
3 结果
3.1 拷贝数变异分布
平和质组平均CNV数为12.63±3.39，最小值为8，最大值为20；阳虚质组平均CNV数为14.94±6.88，最小值为2，最大值为100，按单个样本CNV数超过“均数±3倍标准差”逐步剔除异常值16号和11号样本（CNV数分别为100、53，后续分析均剔除这2个样本），去掉2个异常值后阳虚质平均CNV数为15.04±8.95，最小值为2，最大值为38。2组CNV数比较，差异无统计学意义（P方差不齐，双侧=0.191）。平和质和阳虚质CNV、CNVR在常染色体的分布情况见表2。
3.2 拷贝数变异长度
去掉异常值后阳虚质组平均每个CNV的长度为692.48 kb，最小值1.13 kb，最大值6.21 Mb，中位数4.00 Mb，平均每个样本CNV总长度为10.41 Mb；平和质组平均每个CNV长度为915.93 kb，最小值1.61 kb，最大值29.94 Mb，中位数2.62 Mb，平均每个样本CNV总长度为11.57 Mb。
3.3 阳虚质拷贝数变异区域分布
阳虚质组状态1、状态2、状态5、状态6的CNV数分别为17、77、273、54；平和质组状态1、状态2、状态5、状态6的CNV数分别为16、70、222、71。
从28个阳虚质样本中共检测出26个CNVR，其中有19个增加型CNVR，6个删除型CNVR，1个混合型CNVR（既有删除型CNV又有增加型CNV）。大多数CNVR仅被少数阳虚质受试者共享，仅7个CNVR被不少于5个阳虚质的受试者共享。见表3。
3.4 拷贝数变异区域相关基因
在人类基因组浏览器中，共有11个CNVR含有可能的基因，且这些基因在基因本体（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）或BioCarta基因数据库中存在注释。这些CNVR及其可能包含的基因见表4。
4 讨论
常用的免费CNV分析软件有Affymetrix Power Tools （APT）、Aroma.Affymetrix、PennCNV和CRLMM，均可从Affymetrix 6.0 SNP微阵列平台获取。Affymetrix公司的SNP 6.0微阵列芯片有180万个基因标记，包括90.66万个SNPs和94.6万个CNV探针。PennCNV采用HapMap样本作为参照样本计算Log2（R比值），R为整个实验A、B等位基因标准化信号强度值之和，R比值=R观察/R理论[6]，而Aroma.Affymetrix和APT采用手头的数据作为参照数据，CRLMM采用线性模型评估绝对拷贝数，因此不需要参照样本，CRLMM至少需要10个样本以获得准确的模型参数，PennCNV和APT没有校正背景杂交。仅PennCNV提供CNV特有的质量控制指标以用于潜在的CNV过少的样本。PennCNV有利于分析位点水平的拷贝数，有利于在单一软件包内评估CNV特有的质量控制指标，PennCNV具有相对较小的偏倚和变异，在与CRLMM具有相似假阳性率时可以检测更多的CNVR[12]。PennCNV软件由于具有良好的分析效能且可免费获取，故被用于本研究的CNV分析。
本研究共入组30例阳虚质，其中被剔除的2个样本被认为不是来自阳虚质正态总体，没有进入后续的分析。28个阳虚质样本共鉴定出421个CNVs，其中74个CNVs仅见于单个阳虚质受试者，故未对这些CNVs可能包含的基因进行检索和注释。共鉴定出92个CNVR，其中67个CNVR也见于平和质受试者，经Fisher精确概率χ2检验，仅1个CNVR被阳虚质共享的例数显著多于被平和质共享的例数（P=0.047），故共对26个CNVR可能包含的基因进行了检索和注释。大多数CNVR被少数阳虚质受试者共享，少数CNVR虽被较多的阳虚质受试者共享，但其包含很少的基因，而且，这些基因在GO、KEGG、BioCarta数据库中无相关注释或仅有少量注释。有些CNVR虽包含较多的基因及其注释，但仅被2～3个阳虚质受试者共享。还有一些CNVR未包含可能的基因，这些CNVR也许位于DNA的非基因编码区，因为人类染色体中编码基因的碱基对数量占整个DNA碱基对总数的比例低于2%。
按GO、KEGG和BioCarta注释，阳虚质特异的CNVR所包含代表基因的功能可以分为几类：一为细胞内外信号转导，如G蛋白偶联信号通路、GTP结合、三磷酸肌醇信号通路、胰岛素信号通路、丝裂原活化的蛋白激酶信号通路均为人体内重要的信号通路，这些通路上编码某些蛋白的基因异常会导致相应表达产物的异常，从而对某些生理功能产生重要影响。二为代谢调节，如组氨酸代谢、氧化还原酶活性、药物代谢、脂肪酸代谢、脂质代谢过程、前体代谢产物和能量的生成、类固醇生物合成代谢，编码这些代谢调节因子的基因异常，也许会导致脂肪代谢异常，从而影响能量的产生而出现不耐寒冷的表现。三是与免疫反应有关，如T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路，这些受体信号通路上相关调节因子的编码基因异常，也许会影响T细胞和B细胞的功能，从而导致阳虚质者免疫功能的异常而易于感冒。 目前采用SNP基因分型芯片研究中医体质和证候的研究罕见报道。Liu等[13]采用家系研究的方法，观察了11个家族性肾阳虚者基因组的CNVs，结果显示肾阳虚者基因组CNVs的两侧基因可以分为几类，其中删除型CNVs两侧基因的生物学通路可分为结合与转运、细胞周期、信号转导及免疫反应，而增加型CNVs两侧基因的生物学通路可分为结合与转运、生物发生、神经系统发育、代谢调节及免疫反应，即肾阳虚者的代谢、生物起源、发育、信号转导和免疫反应等重要的生理功能减退。Liu等研究的受试对象为家族性肾阳虚者，与中医阳虚体质具有类似的形寒肢冷表现，所采用的芯片为Affymetrix 100 K芯片，采用Affymetrix的CNAT4.0软件分析CNVs。本研究与该研究具有一定的可比性，在CNVs所含基因的生物学注释上也具有一定的相似性。
总之，本研究采用SNP6.0基因 分型芯片对阳虚质者基因组的CNVs进行了检测，共鉴定出26个阳虚质特异的CNVR，这些CNVR可能含有一些与信号转导、物质代谢（能量代谢）、免疫反应相关的基因。由于拷贝数的删除或增加，会影响这些基因的剂量，从而导致相应表达产物数量的变化，最终形成某些阳虚质“性状”。本研究结果显示，禀赋遗传是阳虚质的主要成因，阳虚质者存在基因组结构基因的变异，阳虚质特征不是由单个基因决定的。由于本研究的样本量少，且很少类似研究可资借鉴，故本研究的主要意义在于方法的尝试，及阳虚质基因组CNVs的初步揭示，所得结果尚需大样本及家系研究的进一步确认。
参考文献：
[1] 王琦，郑守曾，项平，等.中医体质学[M].北京：人民卫生出版社，2005：2.
[2] 姚实林，王琦.阳虚质成因论析[J].中国中医基础医学杂志，2008， 14（6）：405-407.
[3] Lou H， Li S， Yang Y， et al. A map of copy number variations in Chinese populations[J]. PLoS One，2011，6（11）：e27341.
[4] Gao XL， Huang J. A robust penalized method for the analysis of noisy DNA copy number data[J]. BMC Genomics，2010，11：517.
[5] Jiang L， Jiang J， Wang J， et al. Genome-wide identification of copy number variations in Chinese Holstein[J]. PLoS One，2012， 7（11）：e48732.
[6] Wang K， Li M， Hadley D， et al. PennCNV：an integrated hidden Markov model designed for high-resolution copy number variation detection in whole-genome SNP genotyping data[J]. Genome Res， 2007，17（11）：1665-1674.
[7] Lin CH， Li LH， Ho SF， et al. A large-scale survey of genetic copy number variations among Han Chinese residing in Taiwan[J]. BMC Genet，2008，9：92.
[8] 朱燕波，王琦，陈柯帆，等.8448例一般人群的中医体质类型与健康状况关系的分层分析[J].中西医结合学报，2011，9（4）：382-389.
[9] 姚实林，张祖志，杨新胜，等.基于974例调查数据的中医兼夹体质分析[J].中西医结合学报，2012，10（5）：508-515.
[10] 中华中医药学会.中医体质分类与判定[M].北京：中国中医药出版社，2009.
[11] Sha BY， Yang TL， Zhao LJ， et al. Genome-wide association study suggested copy number variation may be associated with body mass index in the Chinese population[J]. J Hum Genet，2009，54（4）：199.
[12] Eckel-Passow JE， Atkinson EJ， Maharjan S， et al. Software comparison for evaluating genomic copy number variation for Affymetrix 6.0 SNP array platform[J]. BMC Bioinformatics，2011，12：220.
[13] Liu WW， Gao YX， Zhou LP， et al. Observations on copy number variations in a kidney-yang deficiency syndrome family[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2011，2011：ID 548358.
（收稿日期：2013-05-12，编辑：陈静）