【摘 要】
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【目的】为了进一步提高毕赤酵母表达生产人胰岛素前体的产量,【方法】将构建的表达载体pPICZα-IP电转至毕赤酵母X-33中,在100μg/mL zeocin的YPDS抗性平板筛选获得过量表达
【机 构】
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江南大学食品科学与技术国家重点实验室; 江南大学工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学无锡医学院;
【基金项目】
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中组部首批青年拔尖人才支持计划;江苏省杰出青年基金(BK2012002);教育部创新团队发展计划(IRT1249);国家自然科学基金(31101229)~~
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【目的】为了进一步提高毕赤酵母表达生产人胰岛素前体的产量,【方法】将构建的表达载体pPICZα-IP电转至毕赤酵母X-33中,在100μg/mL zeocin的YPDS抗性平板筛选获得过量表达人源胰岛素前体(IP)的重组菌株B4和S6。在此基础上,以过量表达胰岛素前体的B4和S6为出发菌株,以SacI线性化的表达载体pPICZα-IP进行重复电转化,并在1000μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选获得一株拷贝数为7的重组毕赤酵母2B4。【结果】该菌株在5 L规模发酵罐上,人源胰岛素前体产量是低拷贝数菌株B7的2.7倍,且菌体并未因拷贝数高而表现出生长不良的现象。实时定量PCR检测后,发现2B4菌株胰岛素前体基因的转录水平是B7的2倍。【结论】综上结果表明,采用抗性筛选和重复电转相结合的高拷贝重组毕赤酵母构建策略,能有效促进目的基因的转录水平,最终显著提高目标蛋白的产量。
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