探讨microRNA–709(miR–709)在顺铂引起肾小管上皮细胞损伤模型中的作用及机制。
方法体外培养小鼠肾小管上皮细胞，予不同浓度(0、1、5、10、20 μmol/L)顺铂刺激24 h，以10 μmol/L顺铂刺激不同时间(0、2、6、12、24 h)。采用实时荧光定量PCR(RT–PCR)技术检测细胞miR–709的表达变化。实验组分为上调对照组、miR–709过表达组、下调对照组、miR–709下调组，其中miR–709下调组和下调对照组加顺铂刺激。应用Annexin V–FITC/PI双染法检测细胞凋亡，分光光度法检测含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(Caspase–3)活性，Western blot法和RT–PCR检测上皮细胞标志蛋白E–cadherin及其mRNA的变化。JC–1(线粒体膜电位)荧光探针检测线粒体膜电位，流式细胞术检测线粒体超氧化物(mitoSOX)生成，PCR检测线粒体基因(mtDNA)拷贝数。
结果miR–709在5 μmol/L顺铂刺激小管上皮细胞后开始明显升高(F＝22.17，P<0.05)，10 μmol/L顺铂刺激12 h开始明显升高(F＝33.462，P<0.05)；过表达miR–709后细胞凋亡数目、Caspase–3活性较上调对照组增加，E–cadherin表达较上调对照组下降，差异均有统计学意义(凋亡：1.54±0.20比1.00±0.23；Caspase–3活性：1.27±0.08比0.97±0.08；E–cadherin：0.47±0.15比1.00±0.10；t＝–3.086、–5.882、5.671，P均<0.05)；线粒体功能指标线粒体膜电位、mtDNA拷贝数较对照组降低，mitoSOX生成较对照组增加，差异均有统计学意义(JC–1：0.80±0.04比1.05±0.08；mtDNA：0.58±0.15比1.00±0.75；mitoSOX：1.31±0.16比1.00±0.05; t＝4.687、4.943、–3.694，P均<0.05)。而顺铂刺激后，miR–709下调组细胞凋亡数目、Caspase–3活性较下调对照组降低，E–cadherin表达较下调对照组增高，差异均有统计学意义(凋亡：1.35±0.10比1.86±0.44；Caspase–3活性：1.04±0.12比1.30±0.09；E–cadherin：0.86±0.08比0.54±0.05；F＝18.489、20.932、33.323，P均<0.05)；线粒体膜电位、mtDNA拷贝数较对照组增加，mitoSOX生成较下调对照组降低，差异均有统计学意义(JC–1：0.94±0.06比0.75±0.05；mtDNA：0.68±0.09比0.27±0.12；mitoSOX：0.91±0.09比1.22±0.08；F＝21.726、59.330、23.813，P均<0.05)。
结论miR–709可能通过负性调控线粒体功能参与顺铂引起的肾小管上皮细胞损伤。