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摘 要：美罗培南为人工合成的广谱碳青霉烯类抗生素，容易穿透大多数革兰阳性和阴性细菌的细胞壁。本实验对美罗培南无菌检查方法进行验证。方法：采用薄膜过滤法以600ml/筒缓冲液冲洗量检查，结果：美罗培南对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。
关键词：美罗培南；无菌检查；验证
美罗培南化学名称为：（4R，5S，6S）-3-[[（3S，5S）-5-（二甲基氨甲酰基）-3-吡咯烷]硫]-6-[（1R）-1-羟乙基]-4-甲基-7-氧-1-氮双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸三水合物。美罗培南为人工合成的广谱碳青霉烯类抗生素，容易穿透大多数革兰阳性和阴性细菌的细胞壁，而达到其作用靶点青霉素结合蛋白美罗培南与氨基糖苷类抗生素合用可产生协同作用[1-5]。美罗培南适用于成人和儿童由单一或多种对美罗培南敏感的细菌引起的肺炎、子宫内膜炎、皮肤软组织感染、败血症等。无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法[6-13]。本实验对美罗培南无菌检查方法进行验证。
1 试验环境与材料
1.1 试验环境：在环境洁净度为B+A的无菌室中进行。
1.2 仪器：NKF330一次性全封闭集菌培养器（温州图旺生物技术设备有限公司）、HTY-601智能集菌仪（温州图旺生物技术设备有限公司）、HY-2（A）调速多用振荡器（东莞康润仪器设备有限公司）、SPX-250智能生化培养箱（北京北瑞达医药科技有限公司）、MJX-150B智能霉菌培养箱（北京北瑞达医药科技有限公司）、YXQ-LS-30SII高压灭菌锅（西安常仪仪器设备有限公司）、FB224电子分析天平（上海析友分析仪器有限公司）。
1.3 试验用菌株：生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代（上海北诺生物科技有限公司）、白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）（上海北诺生物科技有限公司）、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）（上海北诺生物科技有限公司）、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）（上海北诺生物科技有限公司）、大肠埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）（上海北诺生物科技有限公司）、黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）（上海北诺生物科技有限公司）。
1.4 培养基、稀释液及缓冲液
1.4.1 干粉培养基：硫乙醇酸盐培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、改良马丁琼脂培养基（威海新月化玻仪器有限公司）、改良马丁培养基（杭州驰成医药科技有限公司）、玫瑰红钠琼脂培养基（上海研域生物科技有限公司）、营养琼脂培养基（杭州百思生物技术有限公司）。
1.4.2 细菌稀释液：氯化钠溶液（天津市津东天正精细化学试剂厂）。
1.4.3 冲洗用缓冲液：pH 7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液（天津市津东天正精细化学试剂厂）。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
2.1.1 取经30℃～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
2.1.2 取经30℃～35℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7备用。
2.1.3 取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。
2.1.4 取经23℃～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。
2.2 菌液计数：每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入约15毫升、45摄氏度改良马丁琼脂平皿，经26摄氏度生化培养箱培养72小时，金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液、大肠埃希菌液各1ml，注入约15 毫升、45摄氏度营养琼脂平皿，经36摄氏度生化培养箱培养48小时，活菌计数。生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）菌落数69cfu/ml，白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）菌落数71cfu/ml，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）菌落数73cfu/ml，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）菌落数70cfu/ml，大肠埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）菌落数79cfu/ml，黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）菌落数66cfu/ml。
2.3 方法的验证采用薄膜过滤法
2.3.1 供试液制备。取供试品3克溶于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于七个滤筒中过滤，冲洗液用量为每筒600 ml，每次50ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液（约为10～100个/筒），依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基，按规定条件培养14天。逐日观察。
2.3.2 对照组：另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.3 供试品对照组：取供试品3克，溶于600ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于2个滤筒中过滤，冲洗滤膜数次，每次50ml，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部无菌检查法，按规定条件培养14天，逐日观察。 2.3.4 空白对照组：取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.5 阴性对照组：取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液及0.9%的无菌氯化钠溶液适量，分置于两个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.6 培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30～35℃培养；真菌培养基桶23～28℃培养，培养 14天。每天观察并记录。
结果表明，美罗培南对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。美罗培南采用薄膜过滤法进行无菌检查时，缓冲液冲洗量以600 ml/筒为宜，可以选择大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。
参考文献
[1]徐颖鹤，楼永海，郑贞苍，林荣海.美罗培南在连续性肾脏替代治疗患者中的药代动力学[J].中国临床药理学杂志，2008（5）.
[2]祁志高，谷祥富，张石云.美罗培南治疗慢性盆腔炎的临床研究[J].中国实用医药，2008（19）.
[3]万楚成，张霞，夏云金，章正华，龙志国，舒卫东.美罗培南在急性白血病并发感染中的应用[J]. 临床血液学杂志，2008（5）.
[4]罗书香.药品微生物限度检查方法验证资料分析[J].中国药事，2007（7）.
[5]许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005（4）.
[6]陈秀勤，刘炳茹，乙静平.常见抗生素的无菌检查法最佳冲洗条件的考察[J].中国药品标准，2004（4）.
[7]蔡国华.对注射用阿昔洛韦无菌检查方法的改进[J].海峡药学，2003（4）.
[8]张晓明，何晓英.青霉素粉针剂无菌检查方法的实验研究[J].中国抗生素杂志，2004（4）.
[9]乐正永.无菌检查方法验证资料分析[J].中国现代药物应用，2008（23）.
[10]朱会琴，李奋勇，李凯，王建宁，沈晓华.几种微生物限度检查方法的比较[J].西北药学杂志，2007（6）.
[11]吴潇.近年来我国药品微生物限度检查方法验证概况[J].中国现代药物应用，2008（20）.
[12]付小平.智能集菌仪用于小容量注射剂的无菌检查[J].中国药师，2004（7）.
[13]葛欣.利用净化工作台进行注射液的无菌检查[J].中国医院药学杂志，1988（6）.
关键词：美罗培南；无菌检查；验证
美罗培南化学名称为：（4R，5S，6S）-3-[[（3S，5S）-5-（二甲基氨甲酰基）-3-吡咯烷]硫]-6-[（1R）-1-羟乙基]-4-甲基-7-氧-1-氮双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸三水合物。美罗培南为人工合成的广谱碳青霉烯类抗生素，容易穿透大多数革兰阳性和阴性细菌的细胞壁，而达到其作用靶点青霉素结合蛋白美罗培南与氨基糖苷类抗生素合用可产生协同作用[1-5]。美罗培南适用于成人和儿童由单一或多种对美罗培南敏感的细菌引起的肺炎、子宫内膜炎、皮肤软组织感染、败血症等。无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法[6-13]。本实验对美罗培南无菌检查方法进行验证。
1 试验环境与材料
1.1 试验环境：在环境洁净度为B+A的无菌室中进行。
1.2 仪器：NKF330一次性全封闭集菌培养器（温州图旺生物技术设备有限公司）、HTY-601智能集菌仪（温州图旺生物技术设备有限公司）、HY-2（A）调速多用振荡器（东莞康润仪器设备有限公司）、SPX-250智能生化培养箱（北京北瑞达医药科技有限公司）、MJX-150B智能霉菌培养箱（北京北瑞达医药科技有限公司）、YXQ-LS-30SII高压灭菌锅（西安常仪仪器设备有限公司）、FB224电子分析天平（上海析友分析仪器有限公司）。
1.3 试验用菌株：生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代（上海北诺生物科技有限公司）、白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）（上海北诺生物科技有限公司）、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）（上海北诺生物科技有限公司）、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）（上海北诺生物科技有限公司）、大肠埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）（上海北诺生物科技有限公司）、黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）（上海北诺生物科技有限公司）。
1.4 培养基、稀释液及缓冲液
1.4.1 干粉培养基：硫乙醇酸盐培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、改良马丁琼脂培养基（威海新月化玻仪器有限公司）、改良马丁培养基（杭州驰成医药科技有限公司）、玫瑰红钠琼脂培养基（上海研域生物科技有限公司）、营养琼脂培养基（杭州百思生物技术有限公司）。
1.4.2 细菌稀释液：氯化钠溶液（天津市津东天正精细化学试剂厂）。
1.4.3 冲洗用缓冲液：pH 7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液（天津市津东天正精细化学试剂厂）。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
2.1.1 取经30℃～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
2.1.2 取经30℃～35℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-7备用。
2.1.3 取经23℃～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。
2.1.4 取经23℃～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。
2.2 菌液计数：每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入约15毫升、45摄氏度改良马丁琼脂平皿，经26摄氏度生化培养箱培养72小时，金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液、大肠埃希菌液各1ml，注入约15 毫升、45摄氏度营养琼脂平皿，经36摄氏度生化培养箱培养48小时，活菌计数。生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）菌落数69cfu/ml，白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）菌落数71cfu/ml，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）菌落数73cfu/ml，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]（第4代）菌落数70cfu/ml，大肠埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）菌落数79cfu/ml，黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）菌落数66cfu/ml。
2.3 方法的验证采用薄膜过滤法
2.3.1 供试液制备。取供试品3克溶于500ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于七个滤筒中过滤，冲洗液用量为每筒600 ml，每次50ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液（约为10～100个/筒），依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基，按规定条件培养14天。逐日观察。
2.3.2 对照组：另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.3 供试品对照组：取供试品3克，溶于600ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，分别置于2个滤筒中过滤，冲洗滤膜数次，每次50ml，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部无菌检查法，按规定条件培养14天，逐日观察。 2.3.4 空白对照组：取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.5 阴性对照组：取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液及0.9%的无菌氯化钠溶液适量，分置于两个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，按规定条件培养14天，逐日观察。
2.3.6 培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30～35℃培养；真菌培养基桶23～28℃培养，培养 14天。每天观察并记录。
结果表明，美罗培南对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。美罗培南采用薄膜过滤法进行无菌检查时，缓冲液冲洗量以600 ml/筒为宜，可以选择大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。
参考文献
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[3]万楚成，张霞，夏云金，章正华，龙志国，舒卫东.美罗培南在急性白血病并发感染中的应用[J]. 临床血液学杂志，2008（5）.
[4]罗书香.药品微生物限度检查方法验证资料分析[J].中国药事，2007（7）.
[5]许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005（4）.
[6]陈秀勤，刘炳茹，乙静平.常见抗生素的无菌检查法最佳冲洗条件的考察[J].中国药品标准，2004（4）.
[7]蔡国华.对注射用阿昔洛韦无菌检查方法的改进[J].海峡药学，2003（4）.
[8]张晓明，何晓英.青霉素粉针剂无菌检查方法的实验研究[J].中国抗生素杂志，2004（4）.
[9]乐正永.无菌检查方法验证资料分析[J].中国现代药物应用，2008（23）.
[10]朱会琴，李奋勇，李凯，王建宁，沈晓华.几种微生物限度检查方法的比较[J].西北药学杂志，2007（6）.
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