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摘要[目的] 研究花粉超低温保存方法，对于解决植物杂交育种花期不遇问题以及实现种质资源的保存等都具有重要的现实意义。[方法]以鸢尾属植物观赏价值很高的耐寒种玉蝉花为研究对象，对其花粉悬滴法活力检测离体培养基筛选和超低温保存方法进行研究。[结果]玉蝉花花粉活力检测较适合的液体萌发培养基配方为蔗糖150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2150 mg/L+Fe2（SO4）350 mg/L+KNO350 mg/L +MgSO4·7H2O 100 mg/L；超低温保存要采集活力较高的初花期花粉，较适宜含水量为150%～200%，超低温保存后选用自来水水冲化冻，花粉萌发率由保存前的56.04%提升到保存后的60.53%；玉蝉花花药也可作为超低温保存材料，保存后采用自来水水冲化冻其花粉萌发率为54.11%。[结论]保存后的花粉活力符合花粉使用活力要求，可用于指导实践。
关键词玉蝉花；花粉活力；超低温保存
中图分类号S602.4文献标识码A文章编号0517-6611（2016）01-216-04
Abstract[Objective] The aim was to study pollen cryopreservation approaches of Iris ensata， which had a great significance in solving the problem of asynchronous flowering period on cross breeding and indigenous resources conservation. [Method]Using Iris ensata which is a coldresistant species and has high ornamental value as material， the approaches of its pollens cryopreserving ， the viability detection of hanging drop culture and the screening of vitro culture medium were studied.[Result]The results showed that the most appropriate culture medium of pollen vigour test was sucrose 150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2 150 mg/L+Fe2（SO4）3 50 mg/L+KNO3 50 mg/L +MgSO4·7H2O 100 mg/L. The pollens cryopreserving should collect pollen in early flowering stage and the pollen vigour was strong .The suitable moisture content was 150%-200%. Besides， the way to unfreeze them after cryopreservation was by running water. The pollen germination rate improved from 56.04% to 60.53%. The anthers of Iris ensata could also be materials of cryopreservation， the pollen germination rate was 54.11% unfreezing by running water after the cryopreservation. [Conclusion] The pollen viability after the cryopreservation meet needs of pollen viability application， and can be used for guiding practices.
Key wordsIris ensata； Pollen viability；Cryopreservation
超低温保存技术目前被认为是保存植物材料最有效、最理想的方法，在液氮环境下，植物材料所有的生命代谢活动几乎完全停止[1-2]，可以实现永久、安全、无污染地保存植物材料的优质遗传基因；可以保持组织培养植物形态发生的能力，利于植物种质永续利用和便于不同地区间的种质交换；并且超低温保存具有在使用设备上和保存过程操作上都比较简单的优势。花粉的超低温保存，也是植物种质资源保存的一种方式，可以有效地延长花粉寿命，在应用时不受花期的限制。目前花粉的超低温保存研究很多，主要集中在李树[3] 、马铃薯[4]、甘蓝型油菜[5]、小麦[6]等果树和农作物上，并取得顯著保存效果。观赏植物芍药、玉兰、梅花[7]等的花粉超低温保存也比较成功，但草本花卉报道较少。鸢尾属植物是观赏价值较高的观花植物，国内外都比较注重特殊花型和花色新品种的培育，培育方法仍以杂交育种为主，花粉的有效储藏对解决杂交育种亲本花期不遇问题具有重要意义[8-9]。近年来鸢尾属植物研究还涉及花粉单倍体育种、花粉遗传特性等，对花粉需求越来越多，但花期限制的问题也日益凸显，因此开展鸢尾属植物花粉超低温保存技术研究非常必要。
玉蝉花（Iris ensata Thunb.）是鸢尾属中夏花的耐寒种，主要分布在我国东北地区及俄罗斯等地。其株型特别，叶片青翠似剑，花为深蓝紫色，花朵硕大，适合布置水生鸢尾专类园或在池旁、湖畔点缀，它不仅是园林绿化和湿地修复的优良观花观叶种类，在切花应用上也是极好的材料[10-13]。笔者以玉蝉花花粉为材料进行超低温保存研究，研究结果既可以有效地保护玉蝉花种质资源又可为鸢尾属植物耐寒杂交育种提供充足的花粉，同时为鸢尾属植物其他种质花粉超低温贮存研究和种质资源保存研究提供参考。 1材料与方法
1.1试验材料
玉蝉花花粉于2014年6月中旬采自东北林业大学帽儿山试验基地。
1.2试验方法
1.2.1花粉采集。
选择天气晴朗早晨采集玉蝉花花蕾，将其放入硫酸纸袋后带回实验室，然后将花药从花蕾中取出后放在硫酸纸上，用解剖针将花粉从花药上剥离后放在硫酸纸上，每一处理采集10个植株上的花粉，均匀混合后进行试验。
1.2.2花粉活力测定方法。
采用悬滴法进行花粉活力检测。最适培养基的筛选采用2因素即蔗糖（100、150和200 g/L）與H3BO3（100、200 mg/L）组合试验。上述培养基均添加CaCl2 150 mg/L、Fe2（SO4）3 50 mg/L、KNO3 50 mg/L和MgSO4·7H2O 100 mg/L，混合均匀后放在4 ℃冰箱中保存、备用。用移液枪在单凹片的载玻片凹陷处滴加20 μL培养液，再用解剖针蘸取玉蝉花花粉均匀撒在培养液上，不要堆积。盖上盖玻片，再用培养液在盖玻片周围封片。将做好的玻片放在有湿润滤纸的培养皿内，以保持载玻片湿润，在温度为（25±2）℃的黑暗培养箱中进行花粉萌发培养，培养时间2 h。花粉萌发的标准是以花粉管长度超过花粉直径的2倍为宜。每个处理重复3次，每个重复随机选取4个视野统计萌发率。
花粉萌发率=某视野萌发花粉数/该视野统计花粉总数×100%
1.2.3花粉含水量测定。
采用烘干法。将烘箱的温度调至（105±2）℃，测得安瓿瓶重量（a）；然后加入0.4 g左右新鲜花粉，再称安瓿瓶和花粉的重量（b）；放入烘箱内，打开安瓿瓶盖，在温度（105±2）℃下烘干2 h后封口取出，放入干燥器内，冷却20～30 min，取出称重（c）。
花粉的含水量设为d，即d=[（b-c）/（b-a）]×100%
式中，a为安瓿瓶重量（g），
b为安瓿瓶及测定样品烘干前的重量（g），
c为安瓿瓶及测定样品烘干后的重量（g）。
1.2.4花粉的脱水处理。
采用白炽灯照射脱水法降低花粉的含水量，用普通型的220 V、60 W可调节台式白炽灯，调节灯泡至花粉的距离为15 cm处开灯加热，烘干脱水。每1 h测量一次含水量。
1.2.5玉蝉花花粉的超低温保存及解冻方法。
将经过适度干燥的玉蝉花花粉用锡箔纸包好后放入1.8 ml冻存管中，花粉的量不能超过冻存管容积的2/3，之后将瓶盖拧紧，标记好的冻存管放在冻存管架上投入液氮（-196 ℃）中。在液氮中冻存24 h后，将冻存管从液氮中取出，采用不同的化冻方法解冻：室温化冻约30 min，为慢速化冻；40 ℃水浴化冻5～6 min，为快速化冻；自来水水冲化冻6～7 min，为室温化冻。之后即可进行保存后的花粉活力检测。对保存效果好的花粉在保存1年后再次进行活力检测。
1.3数据分析
采用SPSS17.0和Excel软件对所测数据进行统计分析，用Duncan法对各测定数据进行多重比较。
2结果与分析
2.1花粉离体萌发培养基的筛选
由表1可知，玉蝉花的花粉离体萌发培养不仅与蔗糖浓度有关，也受硼酸浓度的影响，当硼酸浓度一致时，玉蝉花花粉萌发率随着蔗糖浓度的增加呈先升高后稍有所下降的趋势，但下降差异不显著（P<0.05）。这说明当蔗糖浓度达到花粉萌发所需要的浓度后过多的蔗糖不会促进花粉萌发，但也不会抑制花粉萌发。硼酸对玉蝉花花粉萌发的影响趋势与蔗糖相同。当蔗糖浓度为 150 g/L，硼酸浓度为200 mg/L时，花粉萌发2 h时花粉萌发率最高达到（55.86±3.73）%，由此可知，玉蝉花花粉离体萌发适宜的培养基配方为蔗糖150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2 150 mg/L+Fe2（SO4）3 50 mg/L+KNO3 50 mg/L+MgSO4·7H2O 100 mg/L。
2.2不同花期玉蝉花花粉萌发率比较
由表2可知，采用
萌发法测得的花粉活力为初花期和盛花期较高，从透色期到末花期花粉活力呈先升高后降低的趋势，在初花期花粉活力达到最高，为（57.65±7.24）%，但与盛花期花粉活力（5187±3.06）%差异不显著。盛花期花粉活力虽较高，但此时期花药开裂，花粉极容易在采集过程中散去，所以采用初花期花粉作为保存材料在取样时更方便。在花粉活力检测方法中，通常认为花粉萌发法更能直观、有效地证明花粉萌发能力，所以后期花粉保存后活力检测都采用萌发法。
2.3不同含水量玉蝉花花粉在超低温保存后不同化冻方法下萌发率比较
采集玉蝉花初花期花粉，采用白炽灯照射脱水法获得不同含水量花粉。测得初始含水量为27.5%，经过1 h的白炽灯烘干干燥获得含水量为200%的花粉，经过2 h左右的干燥获得含水量为150%的花粉，再经过3 h左右的干燥获得含水量为100%的花粉。对获得的不同含水量花粉进行超低温保存及不同化冻方法的研究。
由表3可知，玉蝉花花粉超低温保存的成功与含水量和超低温保存后的化冻方式有关。新鲜花粉（CK）的初始含水量为27.5%，保存前萌发率为（56.04±6.65）%，但超低温保存后萌发率有所下降，且差异显著（P<0.05），效果较好的水浴化冻花粉萌发率降为（49.66±5.90）%；通过干燥法降低含水量后的花粉相对新鲜花粉萌发率虽有所降低，但超低温保存后花粉萌发率却有所升高，而且水浴化冻或自来水化冻花粉萌发率都高于室温化冻，且差异显著，由此可知，玉蝉花花粉超低温保存后不适合缓慢化冻。当玉蝉花花粉含水量降至200%时，超低温保存后水浴化冻和自来水化冻萌发率分别为（58.35±4.32）%、（60.53±6.12）%，且差异不显著；当含水量降至150%时水浴化冻萌发率最高，为（58.86±276）%，与自来水化冻萌发率差异不显著；当含水量降至100%时自来水化冻萌发率最高，为（52.55±2.73）%，与水浴化冻萌发率差异不显著；且花粉含水量降至200%、150%时超低温保存后在水浴化冻和自来水化冻方式下的萌发率高于新鲜花粉保存前的萌发率（56.04±6.65）%及其他处理，且差异显著。将含水量200%的花粉保存1年后用自来水水 冲化冻，萌发率为59.58%，与保存24 h后的检测结果接近，差异不显著。
由此可知，玉蝉花花粉超低温保存适合含水量为150%～200%，化冻方式选用水浴化冻和自来水化冻方式均可。但在试验过程中水浴化冻方式冻存管有暴破现象，为了安全考虑，建议采用自来水化冻方式。相比较而言，自来水化冻方式不仅花粉萌发率高，与水浴化冻方式相比更加安全、方便、易于操作。通常认为植物超低温保存过程中对植物的伤害主要在冷冻和解冻这2个过程，所以要提高花粉超低温保存的成功率，选择比较适宜的化冻方法同样非常重要。
2.4玉蝉花花粉和花药超低温保存效果比较
因为花药取材及运输比较方便，将初花期的花药直接进行超低温保存，进一步检测其保存效果。采用的化冻方式是自来水水冲，花药超低温保存前花粉活力为57.65%，保存后花粉活力为54.11%，虽然花药超低温保存后萌发率有所下降，但与花粉直接保存后的花粉活力差异不显著。这表明玉蝉花花药也可以作为超低温保存材料实现花粉的保存。
3讨论
3.1花粉超低温保存适宜的采集时期
植物花粉的质量、产量和散粉特点往往受环境及遗传特性等因素的限制，所以不同物种花粉超低温保存适宜的采集时期有明显差别。Dantonio等[14]认为芹菜花粉在一天中不同时间采集其活力不受影响；Marchant等[15]对未开、半开、全开3种状态月季品种的花粉活力进行研究，结果表明，全开或者未开的花朵花粉活力高，尤其是取未开的花朵可以减少花粉交叉污染的风险；梁立等[16]对比了紫菜苔幼嫩花粉、近成熟花粉和成熟花粉3个发育时期认为，成熟花粉的保存效果与近成熟的花粉相似，幼嫩花粉较差；而Craddock等[17]认为山茱萸刚开裂的花药作为保存花粉效果较好；陶清波[18]研究认为牡丹花枝室内瓶插水养获取花粉与室外栽培植株新鲜花粉无差异；该研究的玉蝉花，其花粉最佳采集时期为初花期，这一时期花粉活力较高且花药还没有开裂花粉采集容易且不会被污染。
3.2花粉超低温保存活力检测时间和适宜的含水量
花粉超低温冷冻活力检测通常是在花粉冻存一段时间后进行，研究发现，甘蓝型油菜花粉在液氮中贮藏30、60、90、120 d，贮藏时间对花粉活力大小的影响不显著[5]；马铃薯花粉的超低温保存只是保存前含水量对贮藏后花粉的活力有影响，液氮中的贮藏时间对贮藏后花粉的活力无显著影响[19]；石思信等[20]研究发现‘延安黑麦’花粉在-196 ℃的低温下保存360和362 d后，花粉活力仍保持在较高水平，而且在大田条件下用它们授粉获得较高的结实率。而山龙眼属花粉超低温保存后某些种在保存270 d时萌发率明显升高[21]，腊梅属3个品种的花粉超低温保存1年时，萌发率也比保存前高[22]。该研究也发现类似现象，玉蝉花适宜含水量的花粉在液氮中保存24 h和1年的萌发率差异不大。这主要是因为超低温保存在液氮环境下的植物材料其所有的生命代谢活动几乎完全停止，因而贮藏时间对花粉活力的影响不大，通常认为液氮中保存可以作为永久保存条件。花粉超低温冷冻24 h已足以使花粉冻凝，此时期检测的活力可以代表在液氮中的保存效果。但针对不同物种花粉在液氮中保存的最长期限问题还有待继续跟踪检测，保存后活力升高的原因还有待继续深入研究。
目前研究认为适宜的花粉含水量是实现超低温保存的关键。花粉含水量越高，在進行超低温冷冻过程中，细胞内的水分越容易形成冰晶，导致细胞膜受损，致使保存后的花粉死亡率升高，所以达不到超低温保存的目的。新采集的花粉往往含水量较高，花粉潮湿结块，在液氮保存时，花粉容易结成冰晶，活力丧失，不宜进行贮藏。脱水环节对花粉的超低温保存至关重要，不同植物种类进行花粉超低温保存的适宜含水量不同。如英国山核桃的最适含水量为7.5%以下[23]；广杏的最适含水量为13.2%～20.8%[24]；大接杏为97%～14.6%[24]；张亚利等[7]对梅花花粉的超低温保存结果表明，部分梅花品种花粉含水量高达40%时仍可实现超低温保存；而对于某些材料如番茄[25]、魔芋[26]不经过干燥脱水即可直接投入液氮保存；该研究认为，玉蝉花花粉超低温保存的最适含水量为150%～200%。可见不同植物种类花粉超低温保存的适宜含水量因种而异。降低花粉含水量的方法很多，主要有室温条件下自然脱水、白炽灯照射脱水、将花粉置于干燥的培养皿中用电吹风吹热脱水，该研究采用白炽灯照射脱水，温度掌控不好也会影响花粉活力，今后可尝试其他脱水方法。
3.3花粉超低温保存后适宜的化冻方式
花粉超低温保存后在应用时要采用不同的化冻方法化冻，花粉超低温保存后的化冻方式一般有室温化冻、水浴化冻和自来水化冻等。研究认为，液氮保存对植物伤害发生在冰冻和化冻2个过程，因此要使植物种质的超低温保存获得成功，选择合适的化冻方法非常重要，从而避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，并防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。超低温保存材料在化冻时，有再次结冰的危险，这个危险温度范围是-5～10 ℃，因此化冻通常在温水浴中进行，借助迅速的化冻方式通过此温度区，避免细胞内次生结冰对细胞的致死性破坏。赵树任等[27]研究认为番茄花粉超低温保存后用自来水冲洗是较为理想的化冻方式；Towill[28]在50 ℃水浴中化冻10 s实现了茄属花粉超低温保存；陶清波[18]认为30 ℃的温水对牡丹花粉超低温保存后的化冻效果最佳；而张亚利等[7]认为梅花花粉采用自来水化冻及温水浴化冻效果较好且两者差异不明显。该研究化冻方式选用水浴化冻和自来水化冻均可，差异不大，但在试验过程中水浴化冻冻存管有暴破现象，建议采用自来水化冻。综上所述，花粉超低温保存后化冻方法的选择应根据植物种类及其含水量的不同而有所差异。
植物材料超低温保存效果的影响因素很多。植物的超低温保存是一个非常复杂的过程，对于不同植物以及同一植物不同的材料类型，其超低温保存的难易程度和效果都不同。因此，在进行植物材料保存时，首先要根据植物材料本身的特性，同时对影响保存效果的因素进行研究，并依据前人对这方面的研究经验，筛选能够提高植物材料超低温保存的成活率和再生率的方法和途径，达到对种质资源成功保存的目的。 该试验中花粉超低温保存只采用脱水处理即可实现超低温保存，而无需使用冰冻保护剂，张亚利等[29]在花粉超低温保存研究进展中也指出在花粉超低温保存中，大部分植物材料无需使用冰冻保护剂，同时还提到在花粉超低温保存中，一般不需要经过程序性降温即可实现超低温保存，因而，程序性降温在花粉超低温保存中应用较少。所以，该试验中没有对玉蝉花花粉进行程序性降温处理，而是直接投入液氮。这些都为花粉在超低温保存方面的后续研究提供了很大方便，节省了大量时间、人力、物力和财力。
4结论与建议
4.1结论
玉蝉花花粉离体萌发较为适合的培养基配方：
蔗糖150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2 150 mg/L+Fe2（SO4）3 50 mg/L+KNO3 50 mg/L+MgSO4·7H2O 100 mg/L。可以采集玉蝉花初花期花粉进行超低温保存，最适含水量为150%～200%，化冻方式选用自来水水冲化冻，此时的花粉萌发率由新鲜时的56.04%提高到保存后的6053%。玉蝉花花药也可以实现超低温保存，但花药超低温保存后与保存前对照相比花粉萌发率有所下降，保存后花粉萌发率为54.11%。保存后的花粉活力符合花粉使用生活力要求。
花粉超低温保存流程：首先是采集初花期的花粉（含水量约为27.5%），将花粉从花药中剥离，剥取足量的花粉放在硫酸纸折叠成的小盒中，置于白炽灯下，保持15 cm左右的距离进行花粉超干处理，1 h左右使花粉含水量降到150%～200%，将干燥处理后的花粉用硫酸纸包裹起来后放在冻存管中置于冻存管架上，投入液氮中保存，使用时采用自来水水冲化冻方式。
花药超低温保存流程：采集初花期的花药，将其直接放入冻存管中，将冻存管放在冻存管架上，然后投入液氮中进行保存，在使用时采用的化冻方式是自来水水冲化冻。
4.2建议
花粉萌发培养基的主要成分是各种不同类型的糖。其中，蔗糖被认为是形成花粉管最主要的能量来源。硼酸同样被认为具有促进花粉萌发和花粉管生长的作用。除蔗糖和硼酸外，花粉管的伸长还需要依靠Ca2+来作为细胞壁扩张的主要成分并维持细胞质顶端的离子梯度。而该试验仅进行了蔗糖和硼酸对玉蝉花花粉萌发的影响试验，所以，建议以后进一步研究Ca2+以及其他元素对玉蝉花花粉萌发的影响；建议以后对超低温保存后的玉蝉花花粉与保存之前授粉情况进行比较，进一步探讨其保存效果，并对玉蝉花花粉的超低温保存成功的机理进行研究；建议以后进行玉蝉花花粉重复保存效果的试验。
对花粉的超低温保存研究仅有几十年的历史，我国采用花粉超低温保存技术开展研究的植物品种只有200多种，研究的主要对象是园艺植物和农作物，所以观赏植物花粉种质资源超低温保存库的建立也将是今后的研究趋势。
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关键词玉蝉花；花粉活力；超低温保存
中图分类号S602.4文献标识码A文章编号0517-6611（2016）01-216-04
Abstract[Objective] The aim was to study pollen cryopreservation approaches of Iris ensata， which had a great significance in solving the problem of asynchronous flowering period on cross breeding and indigenous resources conservation. [Method]Using Iris ensata which is a coldresistant species and has high ornamental value as material， the approaches of its pollens cryopreserving ， the viability detection of hanging drop culture and the screening of vitro culture medium were studied.[Result]The results showed that the most appropriate culture medium of pollen vigour test was sucrose 150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2 150 mg/L+Fe2（SO4）3 50 mg/L+KNO3 50 mg/L +MgSO4·7H2O 100 mg/L. The pollens cryopreserving should collect pollen in early flowering stage and the pollen vigour was strong .The suitable moisture content was 150%-200%. Besides， the way to unfreeze them after cryopreservation was by running water. The pollen germination rate improved from 56.04% to 60.53%. The anthers of Iris ensata could also be materials of cryopreservation， the pollen germination rate was 54.11% unfreezing by running water after the cryopreservation. [Conclusion] The pollen viability after the cryopreservation meet needs of pollen viability application， and can be used for guiding practices.
Key wordsIris ensata； Pollen viability；Cryopreservation
超低温保存技术目前被认为是保存植物材料最有效、最理想的方法，在液氮环境下，植物材料所有的生命代谢活动几乎完全停止[1-2]，可以实现永久、安全、无污染地保存植物材料的优质遗传基因；可以保持组织培养植物形态发生的能力，利于植物种质永续利用和便于不同地区间的种质交换；并且超低温保存具有在使用设备上和保存过程操作上都比较简单的优势。花粉的超低温保存，也是植物种质资源保存的一种方式，可以有效地延长花粉寿命，在应用时不受花期的限制。目前花粉的超低温保存研究很多，主要集中在李树[3] 、马铃薯[4]、甘蓝型油菜[5]、小麦[6]等果树和农作物上，并取得顯著保存效果。观赏植物芍药、玉兰、梅花[7]等的花粉超低温保存也比较成功，但草本花卉报道较少。鸢尾属植物是观赏价值较高的观花植物，国内外都比较注重特殊花型和花色新品种的培育，培育方法仍以杂交育种为主，花粉的有效储藏对解决杂交育种亲本花期不遇问题具有重要意义[8-9]。近年来鸢尾属植物研究还涉及花粉单倍体育种、花粉遗传特性等，对花粉需求越来越多，但花期限制的问题也日益凸显，因此开展鸢尾属植物花粉超低温保存技术研究非常必要。
玉蝉花（Iris ensata Thunb.）是鸢尾属中夏花的耐寒种，主要分布在我国东北地区及俄罗斯等地。其株型特别，叶片青翠似剑，花为深蓝紫色，花朵硕大，适合布置水生鸢尾专类园或在池旁、湖畔点缀，它不仅是园林绿化和湿地修复的优良观花观叶种类，在切花应用上也是极好的材料[10-13]。笔者以玉蝉花花粉为材料进行超低温保存研究，研究结果既可以有效地保护玉蝉花种质资源又可为鸢尾属植物耐寒杂交育种提供充足的花粉，同时为鸢尾属植物其他种质花粉超低温贮存研究和种质资源保存研究提供参考。 1材料与方法
1.1试验材料
玉蝉花花粉于2014年6月中旬采自东北林业大学帽儿山试验基地。
1.2试验方法
1.2.1花粉采集。
选择天气晴朗早晨采集玉蝉花花蕾，将其放入硫酸纸袋后带回实验室，然后将花药从花蕾中取出后放在硫酸纸上，用解剖针将花粉从花药上剥离后放在硫酸纸上，每一处理采集10个植株上的花粉，均匀混合后进行试验。
1.2.2花粉活力测定方法。
采用悬滴法进行花粉活力检测。最适培养基的筛选采用2因素即蔗糖（100、150和200 g/L）與H3BO3（100、200 mg/L）组合试验。上述培养基均添加CaCl2 150 mg/L、Fe2（SO4）3 50 mg/L、KNO3 50 mg/L和MgSO4·7H2O 100 mg/L，混合均匀后放在4 ℃冰箱中保存、备用。用移液枪在单凹片的载玻片凹陷处滴加20 μL培养液，再用解剖针蘸取玉蝉花花粉均匀撒在培养液上，不要堆积。盖上盖玻片，再用培养液在盖玻片周围封片。将做好的玻片放在有湿润滤纸的培养皿内，以保持载玻片湿润，在温度为（25±2）℃的黑暗培养箱中进行花粉萌发培养，培养时间2 h。花粉萌发的标准是以花粉管长度超过花粉直径的2倍为宜。每个处理重复3次，每个重复随机选取4个视野统计萌发率。
花粉萌发率=某视野萌发花粉数/该视野统计花粉总数×100%
1.2.3花粉含水量测定。
采用烘干法。将烘箱的温度调至（105±2）℃，测得安瓿瓶重量（a）；然后加入0.4 g左右新鲜花粉，再称安瓿瓶和花粉的重量（b）；放入烘箱内，打开安瓿瓶盖，在温度（105±2）℃下烘干2 h后封口取出，放入干燥器内，冷却20～30 min，取出称重（c）。
花粉的含水量设为d，即d=[（b-c）/（b-a）]×100%
式中，a为安瓿瓶重量（g），
b为安瓿瓶及测定样品烘干前的重量（g），
c为安瓿瓶及测定样品烘干后的重量（g）。
1.2.4花粉的脱水处理。
采用白炽灯照射脱水法降低花粉的含水量，用普通型的220 V、60 W可调节台式白炽灯，调节灯泡至花粉的距离为15 cm处开灯加热，烘干脱水。每1 h测量一次含水量。
1.2.5玉蝉花花粉的超低温保存及解冻方法。
将经过适度干燥的玉蝉花花粉用锡箔纸包好后放入1.8 ml冻存管中，花粉的量不能超过冻存管容积的2/3，之后将瓶盖拧紧，标记好的冻存管放在冻存管架上投入液氮（-196 ℃）中。在液氮中冻存24 h后，将冻存管从液氮中取出，采用不同的化冻方法解冻：室温化冻约30 min，为慢速化冻；40 ℃水浴化冻5～6 min，为快速化冻；自来水水冲化冻6～7 min，为室温化冻。之后即可进行保存后的花粉活力检测。对保存效果好的花粉在保存1年后再次进行活力检测。
1.3数据分析
采用SPSS17.0和Excel软件对所测数据进行统计分析，用Duncan法对各测定数据进行多重比较。
2结果与分析
2.1花粉离体萌发培养基的筛选
由表1可知，玉蝉花的花粉离体萌发培养不仅与蔗糖浓度有关，也受硼酸浓度的影响，当硼酸浓度一致时，玉蝉花花粉萌发率随着蔗糖浓度的增加呈先升高后稍有所下降的趋势，但下降差异不显著（P<0.05）。这说明当蔗糖浓度达到花粉萌发所需要的浓度后过多的蔗糖不会促进花粉萌发，但也不会抑制花粉萌发。硼酸对玉蝉花花粉萌发的影响趋势与蔗糖相同。当蔗糖浓度为 150 g/L，硼酸浓度为200 mg/L时，花粉萌发2 h时花粉萌发率最高达到（55.86±3.73）%，由此可知，玉蝉花花粉离体萌发适宜的培养基配方为蔗糖150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2 150 mg/L+Fe2（SO4）3 50 mg/L+KNO3 50 mg/L+MgSO4·7H2O 100 mg/L。
2.2不同花期玉蝉花花粉萌发率比较
由表2可知，采用
萌发法测得的花粉活力为初花期和盛花期较高，从透色期到末花期花粉活力呈先升高后降低的趋势，在初花期花粉活力达到最高，为（57.65±7.24）%，但与盛花期花粉活力（5187±3.06）%差异不显著。盛花期花粉活力虽较高，但此时期花药开裂，花粉极容易在采集过程中散去，所以采用初花期花粉作为保存材料在取样时更方便。在花粉活力检测方法中，通常认为花粉萌发法更能直观、有效地证明花粉萌发能力，所以后期花粉保存后活力检测都采用萌发法。
2.3不同含水量玉蝉花花粉在超低温保存后不同化冻方法下萌发率比较
采集玉蝉花初花期花粉，采用白炽灯照射脱水法获得不同含水量花粉。测得初始含水量为27.5%，经过1 h的白炽灯烘干干燥获得含水量为200%的花粉，经过2 h左右的干燥获得含水量为150%的花粉，再经过3 h左右的干燥获得含水量为100%的花粉。对获得的不同含水量花粉进行超低温保存及不同化冻方法的研究。
由表3可知，玉蝉花花粉超低温保存的成功与含水量和超低温保存后的化冻方式有关。新鲜花粉（CK）的初始含水量为27.5%，保存前萌发率为（56.04±6.65）%，但超低温保存后萌发率有所下降，且差异显著（P<0.05），效果较好的水浴化冻花粉萌发率降为（49.66±5.90）%；通过干燥法降低含水量后的花粉相对新鲜花粉萌发率虽有所降低，但超低温保存后花粉萌发率却有所升高，而且水浴化冻或自来水化冻花粉萌发率都高于室温化冻，且差异显著，由此可知，玉蝉花花粉超低温保存后不适合缓慢化冻。当玉蝉花花粉含水量降至200%时，超低温保存后水浴化冻和自来水化冻萌发率分别为（58.35±4.32）%、（60.53±6.12）%，且差异不显著；当含水量降至150%时水浴化冻萌发率最高，为（58.86±276）%，与自来水化冻萌发率差异不显著；当含水量降至100%时自来水化冻萌发率最高，为（52.55±2.73）%，与水浴化冻萌发率差异不显著；且花粉含水量降至200%、150%时超低温保存后在水浴化冻和自来水化冻方式下的萌发率高于新鲜花粉保存前的萌发率（56.04±6.65）%及其他处理，且差异显著。将含水量200%的花粉保存1年后用自来水水 冲化冻，萌发率为59.58%，与保存24 h后的检测结果接近，差异不显著。
由此可知，玉蝉花花粉超低温保存适合含水量为150%～200%，化冻方式选用水浴化冻和自来水化冻方式均可。但在试验过程中水浴化冻方式冻存管有暴破现象，为了安全考虑，建议采用自来水化冻方式。相比较而言，自来水化冻方式不仅花粉萌发率高，与水浴化冻方式相比更加安全、方便、易于操作。通常认为植物超低温保存过程中对植物的伤害主要在冷冻和解冻这2个过程，所以要提高花粉超低温保存的成功率，选择比较适宜的化冻方法同样非常重要。
2.4玉蝉花花粉和花药超低温保存效果比较
因为花药取材及运输比较方便，将初花期的花药直接进行超低温保存，进一步检测其保存效果。采用的化冻方式是自来水水冲，花药超低温保存前花粉活力为57.65%，保存后花粉活力为54.11%，虽然花药超低温保存后萌发率有所下降，但与花粉直接保存后的花粉活力差异不显著。这表明玉蝉花花药也可以作为超低温保存材料实现花粉的保存。
3讨论
3.1花粉超低温保存适宜的采集时期
植物花粉的质量、产量和散粉特点往往受环境及遗传特性等因素的限制，所以不同物种花粉超低温保存适宜的采集时期有明显差别。Dantonio等[14]认为芹菜花粉在一天中不同时间采集其活力不受影响；Marchant等[15]对未开、半开、全开3种状态月季品种的花粉活力进行研究，结果表明，全开或者未开的花朵花粉活力高，尤其是取未开的花朵可以减少花粉交叉污染的风险；梁立等[16]对比了紫菜苔幼嫩花粉、近成熟花粉和成熟花粉3个发育时期认为，成熟花粉的保存效果与近成熟的花粉相似，幼嫩花粉较差；而Craddock等[17]认为山茱萸刚开裂的花药作为保存花粉效果较好；陶清波[18]研究认为牡丹花枝室内瓶插水养获取花粉与室外栽培植株新鲜花粉无差异；该研究的玉蝉花，其花粉最佳采集时期为初花期，这一时期花粉活力较高且花药还没有开裂花粉采集容易且不会被污染。
3.2花粉超低温保存活力检测时间和适宜的含水量
花粉超低温冷冻活力检测通常是在花粉冻存一段时间后进行，研究发现，甘蓝型油菜花粉在液氮中贮藏30、60、90、120 d，贮藏时间对花粉活力大小的影响不显著[5]；马铃薯花粉的超低温保存只是保存前含水量对贮藏后花粉的活力有影响，液氮中的贮藏时间对贮藏后花粉的活力无显著影响[19]；石思信等[20]研究发现‘延安黑麦’花粉在-196 ℃的低温下保存360和362 d后，花粉活力仍保持在较高水平，而且在大田条件下用它们授粉获得较高的结实率。而山龙眼属花粉超低温保存后某些种在保存270 d时萌发率明显升高[21]，腊梅属3个品种的花粉超低温保存1年时，萌发率也比保存前高[22]。该研究也发现类似现象，玉蝉花适宜含水量的花粉在液氮中保存24 h和1年的萌发率差异不大。这主要是因为超低温保存在液氮环境下的植物材料其所有的生命代谢活动几乎完全停止，因而贮藏时间对花粉活力的影响不大，通常认为液氮中保存可以作为永久保存条件。花粉超低温冷冻24 h已足以使花粉冻凝，此时期检测的活力可以代表在液氮中的保存效果。但针对不同物种花粉在液氮中保存的最长期限问题还有待继续跟踪检测，保存后活力升高的原因还有待继续深入研究。
目前研究认为适宜的花粉含水量是实现超低温保存的关键。花粉含水量越高，在進行超低温冷冻过程中，细胞内的水分越容易形成冰晶，导致细胞膜受损，致使保存后的花粉死亡率升高，所以达不到超低温保存的目的。新采集的花粉往往含水量较高，花粉潮湿结块，在液氮保存时，花粉容易结成冰晶，活力丧失，不宜进行贮藏。脱水环节对花粉的超低温保存至关重要，不同植物种类进行花粉超低温保存的适宜含水量不同。如英国山核桃的最适含水量为7.5%以下[23]；广杏的最适含水量为13.2%～20.8%[24]；大接杏为97%～14.6%[24]；张亚利等[7]对梅花花粉的超低温保存结果表明，部分梅花品种花粉含水量高达40%时仍可实现超低温保存；而对于某些材料如番茄[25]、魔芋[26]不经过干燥脱水即可直接投入液氮保存；该研究认为，玉蝉花花粉超低温保存的最适含水量为150%～200%。可见不同植物种类花粉超低温保存的适宜含水量因种而异。降低花粉含水量的方法很多，主要有室温条件下自然脱水、白炽灯照射脱水、将花粉置于干燥的培养皿中用电吹风吹热脱水，该研究采用白炽灯照射脱水，温度掌控不好也会影响花粉活力，今后可尝试其他脱水方法。
3.3花粉超低温保存后适宜的化冻方式
花粉超低温保存后在应用时要采用不同的化冻方法化冻，花粉超低温保存后的化冻方式一般有室温化冻、水浴化冻和自来水化冻等。研究认为，液氮保存对植物伤害发生在冰冻和化冻2个过程，因此要使植物种质的超低温保存获得成功，选择合适的化冻方法非常重要，从而避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，并防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。超低温保存材料在化冻时，有再次结冰的危险，这个危险温度范围是-5～10 ℃，因此化冻通常在温水浴中进行，借助迅速的化冻方式通过此温度区，避免细胞内次生结冰对细胞的致死性破坏。赵树任等[27]研究认为番茄花粉超低温保存后用自来水冲洗是较为理想的化冻方式；Towill[28]在50 ℃水浴中化冻10 s实现了茄属花粉超低温保存；陶清波[18]认为30 ℃的温水对牡丹花粉超低温保存后的化冻效果最佳；而张亚利等[7]认为梅花花粉采用自来水化冻及温水浴化冻效果较好且两者差异不明显。该研究化冻方式选用水浴化冻和自来水化冻均可，差异不大，但在试验过程中水浴化冻冻存管有暴破现象，建议采用自来水化冻。综上所述，花粉超低温保存后化冻方法的选择应根据植物种类及其含水量的不同而有所差异。
植物材料超低温保存效果的影响因素很多。植物的超低温保存是一个非常复杂的过程，对于不同植物以及同一植物不同的材料类型，其超低温保存的难易程度和效果都不同。因此，在进行植物材料保存时，首先要根据植物材料本身的特性，同时对影响保存效果的因素进行研究，并依据前人对这方面的研究经验，筛选能够提高植物材料超低温保存的成活率和再生率的方法和途径，达到对种质资源成功保存的目的。 该试验中花粉超低温保存只采用脱水处理即可实现超低温保存，而无需使用冰冻保护剂，张亚利等[29]在花粉超低温保存研究进展中也指出在花粉超低温保存中，大部分植物材料无需使用冰冻保护剂，同时还提到在花粉超低温保存中，一般不需要经过程序性降温即可实现超低温保存，因而，程序性降温在花粉超低温保存中应用较少。所以，该试验中没有对玉蝉花花粉进行程序性降温处理，而是直接投入液氮。这些都为花粉在超低温保存方面的后续研究提供了很大方便，节省了大量时间、人力、物力和财力。
4结论与建议
4.1结论
玉蝉花花粉离体萌发较为适合的培养基配方：
蔗糖150 g/L+H3BO3 200 mg/L+CaCl2 150 mg/L+Fe2（SO4）3 50 mg/L+KNO3 50 mg/L+MgSO4·7H2O 100 mg/L。可以采集玉蝉花初花期花粉进行超低温保存，最适含水量为150%～200%，化冻方式选用自来水水冲化冻，此时的花粉萌发率由新鲜时的56.04%提高到保存后的6053%。玉蝉花花药也可以实现超低温保存，但花药超低温保存后与保存前对照相比花粉萌发率有所下降，保存后花粉萌发率为54.11%。保存后的花粉活力符合花粉使用生活力要求。
花粉超低温保存流程：首先是采集初花期的花粉（含水量约为27.5%），将花粉从花药中剥离，剥取足量的花粉放在硫酸纸折叠成的小盒中，置于白炽灯下，保持15 cm左右的距离进行花粉超干处理，1 h左右使花粉含水量降到150%～200%，将干燥处理后的花粉用硫酸纸包裹起来后放在冻存管中置于冻存管架上，投入液氮中保存，使用时采用自来水水冲化冻方式。
花药超低温保存流程：采集初花期的花药，将其直接放入冻存管中，将冻存管放在冻存管架上，然后投入液氮中进行保存，在使用时采用的化冻方式是自来水水冲化冻。
4.2建议
花粉萌发培养基的主要成分是各种不同类型的糖。其中，蔗糖被认为是形成花粉管最主要的能量来源。硼酸同样被认为具有促进花粉萌发和花粉管生长的作用。除蔗糖和硼酸外，花粉管的伸长还需要依靠Ca2+来作为细胞壁扩张的主要成分并维持细胞质顶端的离子梯度。而该试验仅进行了蔗糖和硼酸对玉蝉花花粉萌发的影响试验，所以，建议以后进一步研究Ca2+以及其他元素对玉蝉花花粉萌发的影响；建议以后对超低温保存后的玉蝉花花粉与保存之前授粉情况进行比较，进一步探讨其保存效果，并对玉蝉花花粉的超低温保存成功的机理进行研究；建议以后进行玉蝉花花粉重复保存效果的试验。
对花粉的超低温保存研究仅有几十年的历史，我国采用花粉超低温保存技术开展研究的植物品种只有200多种，研究的主要对象是园艺植物和农作物，所以观赏植物花粉种质资源超低温保存库的建立也将是今后的研究趋势。
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