【摘 要】
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目的构建大鼠微管相关蛋白4(microtubule-ossociated protein 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础.
【机 构】
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第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,成都军区总医院普通外科
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目的构建大鼠微管相关蛋白4(microtubule-ossociated protein 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础.方法设计1对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从大鼠心肌细胞总mRNA中扩增出MAP4 cDNA,并将MAP4 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle2中,构建pShuttle2-MAP4表达质粒.将此表达质粒扩增纯化酶切获得含有目的片段MAP4 cDNA的表达盒与Adeno-X Virul DNA重组并线性化后转染HEK293T细胞,包装产生大鼠MAP4重组腺病毒.并且转染新生大鼠原代心肌细胞,应用免疫组化的方法进行表达鉴定.结果扩增所得的MAP4 cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为大鼠MAP4基因,所得大鼠MAP4重组腺病毒滴度为2.3×108pfu/ml.转染原代心肌细胞48 h后MAP4表达显著增强.结论为研究MAP4的生物学活性及功能的基因治疗提供了基础.
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