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【摘 要】 色谱检验工作长期以来都非常受到国家和相关行业的重视，通过对各种物质的色谱测试，可以发现和提升物质的应用价值。那么，文章通过下文对叶绿素-α、β-胡萝卜素及脱镁叶绿酸-α的高效液相色谱检测的相关内容进行了分析与阐述，从而为有关研究人员在实际工作中提供一定的借鉴作用。
【关键词】 叶绿素-α β-胡萝卜素 脱镁叶绿酸-α 高效液相色谱检测
现阶段，通常应用反相高效液相色谱法检测植物色素及其衍生生物，依据紫外吸收图特征及保留时间定性，可信度不高，并且步骤繁琐，经常会出现阳性过高或者假阳性情况出现。因此，对于相关方面的内容及问题我需要高度的重视起来。
一、实验分析
实验是确保测试工作能够有效被完成的基础所在，但是，在具体的试验过程中，必须要准备出一套符合标准的实验器具，并且，对于实验的具体方法在实际实验的过程中也应该有效的掌握，其中可以参照以下内容进行相关的实验。
1.试剂和仪器
Agilent Eclipse XDB-C18 4.6*150mm，5um的色谱柱，联用仪为美国Agilent 1200系列，冷冻离心机为Thermo ST16-R等。丙酮、乙酸、甲醇色谱纯。铜绿微囊藻（中国科学院水生生物研究所）、叶绿素-α、B-胡萝卜素标样（美国Fluka公司）、脱镁叶绿素-α标样（德国MP Biomedicals， LLC）。
2.确定实验方法
由于脱镁叶绿酸-α的强极性特征，在中性洗脱液里面，它基本无法被保留，一定要利用离子对或者离子抑制的方式完成它在柱子中的保存，乙酸四丁铵、乙酸铵、乙酸一般被用作离子对和离子抑制对来应用，由于方法对液相色谱的检测目的要予以实现。并且，在酸性条件下控制pH，因此需要应用乙酸。又因为不同的pH对B-胡萝卜素和叶绿素-α（Chl-a）的分离影响非常大，通过实验将水的pH值确定出来，一般控制在3.7。一般单纯的用水和甲醇来洗脱β-胡萝卜素和叶绿素-α是无法洗出的，分析到二氯甲烷和乙酸乙酯与水不相融合，堵塞管路和柱子的情况极易发生，而应用甲醇和丙酮通过相应的比例混合到一起，这样能够有效的分开三者。流动相被确定为：丙酮/甲醇=3/7，水/甲醇=2/8。0min：A%=0%，B%=100.5min：A%=100%，B%=0.25min A%=0%，B%=100.，在5min左右控制间隔平衡时间。
通过分析三种物质的紫外等吸收图能够发现，存在410nm的脱镁叶绿酸-α，434nm的叶绿素-α，480nm的B-胡萝卜素，该实验主要是选择了三个通道定量三种物质，这同其他的阐述可能存在差异。
通过分析三种物质的结构能够发现，无荧光吸收存在于β-胡萝卜素中，因此，只能够优化叶绿素-α和脱镁叶绿酸-α.通过其荧光光谱就能够觉察到，405nm为脱镁叶绿酸-α的最佳激发波长，671nm的发射波长，381nm为叶绿素-α最佳激发波长。所以，在进行实验的时候，需要分段设定荧光检测器，参照脱镁叶绿酸-α的荧光特性将0-8.5min设定出来，同时，在8.5min的以后进行设定时，需要参照叶绿素-α的特性。
因为实际情况的差异，通常进行20uL的试验进样量设定。
3.制备样品
在4℃的温度下，将20毫升的铜绿微囊藻培养液制备出来，每15分钟执行一次，将上清液倒掉，将附着在离心管中的藻体用1.5毫升90%的丙酮溶液向着一次性离心管中转移。在4℃的温度下进行20小时的避光，提取之后，将上清液在12000r/min离心10min的条件下获取出来，然后用针头过滤膜过滤，等待下一次的测试。
二、结果和讨论分析
通过上述分析能够发现，在具体实验中，对于其中所得到的相关结果，有必要进行认真的讨论和分析，具体表现在以下几个方面：
1.紫外定量
通过研究脱镁叶绿酸-α荧光光谱图就能够发现其信噪比很高，因此，在对其进行定量的时候，可以应用荧光的方式，而β-胡萝卜素和叶绿素-α的紫外吸收和荧光图的信噪比进行比较，要高出30%，因此，实验中经常会应用紫外定量的方式。
2.制作标线
分别将相应物质构成的几个浓度混标进样，将相应的标准回归曲线绘制出来，进而得到β-胡萝卜素和叶绿素-α及脱镁叶绿酸-α的相应数值，通过相应的分析能够发现，它们都有着非常广泛的线性范围，并且有着非常优越的重现性。
3.分析定量和定性
在存在1.24×105个/mL澡的浓度时，通过高效液相色谱法就可以获取出来，叶绿素-α它的值为：2956ug/L; 494ug/L的为β-胡萝卜素。利用对比样品和荧光光谱图及标样的紫外吸收图能够发现，有紫外吸收无荧光光图存在于脱镁叶绿酸-α保留处，并且存在480nm的最大紫外吸收量，同脱镁叶绿酸-α的最大紫外吸收进行比较还存在着很多的差异，因为其值在410nm。这样应用质谱取代传统的荧光检测器之后，再一次进行取样能够觉察到，（应用负离子、ESI电喷雾源的方法，雾化的压力在0.103Mpa，雾气的流量在5L/min，雾气的温度为325℃，毛细管电压3500V）。该样品中对应的时刻质谱图一级离子和脱镁叶绿酸-α的质谱图中对应时刻一级离子是完全不一样的，这就进一步能够展现出此种物质并非为镁叶绿酸-α，文章上述的实验方法，不但可以满足衍生物和测定色素的相关要求，并且，还能够充分的发挥它定性的作用，在质谱检测的过程中发挥着巨大的作用。
结语
综上所述，进入21世纪以来，在科技发展的推动下，各种新型的分析检测手段为我国药品及健康保健品的发展提供了巨大的推动作用，在对各种药品及健康保健品的研究中占据相当重要的位置。但是，因为生物的多样性和环境的复杂性特征，在进行相关研究和探索的过程中，还经常的会遇到一些问题，需要在实际工作中不断的总结经验，进行克服。叶绿素-α、β-胡萝卜素及脱镁叶绿酸-α是本文在研究中的重要方向，主要目的是探究它们的高效液相色谱分析方法，通过相关的实验进行正确的检测。对此，文章通过上文首先以实验为出发点进行了探究，然后又对实验的结果进行了讨论，通过一系列的分析，从而为有关研究人员在实际工作中提供相应的促进作用。
参考文献
[1]吴振斌，张兵之，张丽萍，贺锋，成水平.叶绿素-a、β-胡萝卜素及脱镁叶绿酸-a的高效液相色谱检测[J].2011（08）.
[2]谭成玉，赵莹，吴迪，李倩，秦永杰，赵廷峣，李伟，曲敏.小球藻培养条件及其抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究[J].精细与专用化学品.2011（08） .
[3]王傳虎，周丽，吴福勇，盛蒂，朱兰保.超临界CO2萃取废弃绿豆种皮中的绿色素[J].食品工业科技.2010（05） .
[4]程红艳，陈军辉，张道来，赵恒强，郑立，臧家业，王小如.超声波辅助提取RP-HPLC法测定浒苔中的叶绿素a、b[J].海洋科学.2010（02）.
[5]张云伟，鄢兵.超高效液相色谱法测定天然β-胡萝卜素软胶囊中β-胡萝卜素[J].现代科学仪器.2013（06） .
作者简介：李智亮（1988-），男，浙江省杭州市人，民族：汉，职称：助理工程师，学历：大学本科。研究方向：药物分析及毒代动力学。
【关键词】 叶绿素-α β-胡萝卜素 脱镁叶绿酸-α 高效液相色谱检测
现阶段，通常应用反相高效液相色谱法检测植物色素及其衍生生物，依据紫外吸收图特征及保留时间定性，可信度不高，并且步骤繁琐，经常会出现阳性过高或者假阳性情况出现。因此，对于相关方面的内容及问题我需要高度的重视起来。
一、实验分析
实验是确保测试工作能够有效被完成的基础所在，但是，在具体的试验过程中，必须要准备出一套符合标准的实验器具，并且，对于实验的具体方法在实际实验的过程中也应该有效的掌握，其中可以参照以下内容进行相关的实验。
1.试剂和仪器
Agilent Eclipse XDB-C18 4.6*150mm，5um的色谱柱，联用仪为美国Agilent 1200系列，冷冻离心机为Thermo ST16-R等。丙酮、乙酸、甲醇色谱纯。铜绿微囊藻（中国科学院水生生物研究所）、叶绿素-α、B-胡萝卜素标样（美国Fluka公司）、脱镁叶绿素-α标样（德国MP Biomedicals， LLC）。
2.确定实验方法
由于脱镁叶绿酸-α的强极性特征，在中性洗脱液里面，它基本无法被保留，一定要利用离子对或者离子抑制的方式完成它在柱子中的保存，乙酸四丁铵、乙酸铵、乙酸一般被用作离子对和离子抑制对来应用，由于方法对液相色谱的检测目的要予以实现。并且，在酸性条件下控制pH，因此需要应用乙酸。又因为不同的pH对B-胡萝卜素和叶绿素-α（Chl-a）的分离影响非常大，通过实验将水的pH值确定出来，一般控制在3.7。一般单纯的用水和甲醇来洗脱β-胡萝卜素和叶绿素-α是无法洗出的，分析到二氯甲烷和乙酸乙酯与水不相融合，堵塞管路和柱子的情况极易发生，而应用甲醇和丙酮通过相应的比例混合到一起，这样能够有效的分开三者。流动相被确定为：丙酮/甲醇=3/7，水/甲醇=2/8。0min：A%=0%，B%=100.5min：A%=100%，B%=0.25min A%=0%，B%=100.，在5min左右控制间隔平衡时间。
通过分析三种物质的紫外等吸收图能够发现，存在410nm的脱镁叶绿酸-α，434nm的叶绿素-α，480nm的B-胡萝卜素，该实验主要是选择了三个通道定量三种物质，这同其他的阐述可能存在差异。
通过分析三种物质的结构能够发现，无荧光吸收存在于β-胡萝卜素中，因此，只能够优化叶绿素-α和脱镁叶绿酸-α.通过其荧光光谱就能够觉察到，405nm为脱镁叶绿酸-α的最佳激发波长，671nm的发射波长，381nm为叶绿素-α最佳激发波长。所以，在进行实验的时候，需要分段设定荧光检测器，参照脱镁叶绿酸-α的荧光特性将0-8.5min设定出来，同时，在8.5min的以后进行设定时，需要参照叶绿素-α的特性。
因为实际情况的差异，通常进行20uL的试验进样量设定。
3.制备样品
在4℃的温度下，将20毫升的铜绿微囊藻培养液制备出来，每15分钟执行一次，将上清液倒掉，将附着在离心管中的藻体用1.5毫升90%的丙酮溶液向着一次性离心管中转移。在4℃的温度下进行20小时的避光，提取之后，将上清液在12000r/min离心10min的条件下获取出来，然后用针头过滤膜过滤，等待下一次的测试。
二、结果和讨论分析
通过上述分析能够发现，在具体实验中，对于其中所得到的相关结果，有必要进行认真的讨论和分析，具体表现在以下几个方面：
1.紫外定量
通过研究脱镁叶绿酸-α荧光光谱图就能够发现其信噪比很高，因此，在对其进行定量的时候，可以应用荧光的方式，而β-胡萝卜素和叶绿素-α的紫外吸收和荧光图的信噪比进行比较，要高出30%，因此，实验中经常会应用紫外定量的方式。
2.制作标线
分别将相应物质构成的几个浓度混标进样，将相应的标准回归曲线绘制出来，进而得到β-胡萝卜素和叶绿素-α及脱镁叶绿酸-α的相应数值，通过相应的分析能够发现，它们都有着非常广泛的线性范围，并且有着非常优越的重现性。
3.分析定量和定性
在存在1.24×105个/mL澡的浓度时，通过高效液相色谱法就可以获取出来，叶绿素-α它的值为：2956ug/L; 494ug/L的为β-胡萝卜素。利用对比样品和荧光光谱图及标样的紫外吸收图能够发现，有紫外吸收无荧光光图存在于脱镁叶绿酸-α保留处，并且存在480nm的最大紫外吸收量，同脱镁叶绿酸-α的最大紫外吸收进行比较还存在着很多的差异，因为其值在410nm。这样应用质谱取代传统的荧光检测器之后，再一次进行取样能够觉察到，（应用负离子、ESI电喷雾源的方法，雾化的压力在0.103Mpa，雾气的流量在5L/min，雾气的温度为325℃，毛细管电压3500V）。该样品中对应的时刻质谱图一级离子和脱镁叶绿酸-α的质谱图中对应时刻一级离子是完全不一样的，这就进一步能够展现出此种物质并非为镁叶绿酸-α，文章上述的实验方法，不但可以满足衍生物和测定色素的相关要求，并且，还能够充分的发挥它定性的作用，在质谱检测的过程中发挥着巨大的作用。
结语
综上所述，进入21世纪以来，在科技发展的推动下，各种新型的分析检测手段为我国药品及健康保健品的发展提供了巨大的推动作用，在对各种药品及健康保健品的研究中占据相当重要的位置。但是，因为生物的多样性和环境的复杂性特征，在进行相关研究和探索的过程中，还经常的会遇到一些问题，需要在实际工作中不断的总结经验，进行克服。叶绿素-α、β-胡萝卜素及脱镁叶绿酸-α是本文在研究中的重要方向，主要目的是探究它们的高效液相色谱分析方法，通过相关的实验进行正确的检测。对此，文章通过上文首先以实验为出发点进行了探究，然后又对实验的结果进行了讨论，通过一系列的分析，从而为有关研究人员在实际工作中提供相应的促进作用。
参考文献
[1]吴振斌，张兵之，张丽萍，贺锋，成水平.叶绿素-a、β-胡萝卜素及脱镁叶绿酸-a的高效液相色谱检测[J].2011（08）.
[2]谭成玉，赵莹，吴迪，李倩，秦永杰，赵廷峣，李伟，曲敏.小球藻培养条件及其抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究[J].精细与专用化学品.2011（08） .
[3]王傳虎，周丽，吴福勇，盛蒂，朱兰保.超临界CO2萃取废弃绿豆种皮中的绿色素[J].食品工业科技.2010（05） .
[4]程红艳，陈军辉，张道来，赵恒强，郑立，臧家业，王小如.超声波辅助提取RP-HPLC法测定浒苔中的叶绿素a、b[J].海洋科学.2010（02）.
[5]张云伟，鄢兵.超高效液相色谱法测定天然β-胡萝卜素软胶囊中β-胡萝卜素[J].现代科学仪器.2013（06） .
作者简介：李智亮（1988-），男，浙江省杭州市人，民族：汉，职称：助理工程师，学历：大学本科。研究方向：药物分析及毒代动力学。