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摘要：从形态学和细胞学基础方向研究了春萝h不育系4—05A，以保持系4—05B为对比。观察并测量花器官雌雄蕊形态，确认4—05A比4—05B的花长势弱，雄蕊花药外形小、中空无花粉，雌蕊花柱较长。采用花粉压片法观察小孢子母细胞减数分裂及雄配子体发育过程，证明该不育系材料为花粉败育型。不育系4—05A的小孢子母细胞能正常进行减数分裂并形成单核花粉。但雄配子体进一步发育过程中。在单核中期到靠边期的发育阶段小孢子发生败育，不能形成可育的成熟花粉粒。减数分裂胞质分裂方式为同时型。
关键词：春萝卜；雄性不育系；4—05A；减数分裂；雄配子体；败育
萝卜(Raphanus sativus L.)是一种原产于我国的重要世界性蔬菜，其杂种优势明显。雄性不育性是作物杂种优势利用的重要手段，自1968年Ogura在日本鹿儿岛首次发现萝卜雄性不育株育成不育系，我国学者也对其不育性遗传机制进行了研究并转育应用。目前，利用雄性不育系配制生产的萝卜一代杂种已在全国各地广泛推广。春萝卜雄性不育系4-05A及其保持系4-05B是由山西省农业科学院蔬菜研究所萝卜遗传育种课题组选育的优良不育系，目前已在生产上应用配制杂交种。由于植物雄性不育花药败育时期和方式多样，为深入了解春萝卜雄性不育系4-05A的花药败育途径，本研究对该雄性不育系的花器官形态、小孢子母细胞减数分裂过程及其雄配子体发育和败育时期进行了观察和比较，以便为其雄性不育的遗传规律和性状调控研究提供理论依据，更好地利用这一育种途径。
1 材料与方法
1.1材料
春萝卜雄性不育系4-05A及其相应的保持系4-05B供试材料由山西省农业科学院蔬菜研究所萝卜育种课题组提供。
1.2方法
1.2.1 田间试验为保证萝卜雄性不育系种子纯度和质量，采用温室隔离种植及大株采种。2008年春季将前1年收获的春萝卜雄性不育系4-05A及其相应保持系4-05B的越冬种萝卜种植于山西省农业科学院蔬菜研究所日光温室，并采取隔离种植措施。花期人工授粉，将保持系花粉授给不育系从而收获种子。
1.2.2不育系及其相应保持系雌雄蕊形态解剖测量 在盛花期分别随机取20朵不育系和保持系当天开放的花，在体视显微镜下解剖观察，测量其四强及二弱雄蕊的长、宽度和柱头高出四强雄蕊的长度，然后求其平均数及标准差。
1.2.3 小孢子母细胞减数分裂过程及雄配子体发育观察根据经验。萝.花序在晴天10：00-11：00细胞分裂最旺盛，摘取未开花的完全花序固定于卡诺固定液(V无水乙醇：V冰醋酸=3：1)24 h，经95％、85％乙醇洗涤各20 min后转入70％乙醇中，于4℃冰箱保存备用。制片时从花序上挑取一定大小的单个小花苞，解剖镜下剥出花药。本品种花蕾直径1-1.5 mm时小孢子母细胞发育为减数分裂期，其他花粉发育时期可根据花蕾直径大小推测，一般同一花序并不能包括全部发育时期，需多取样寻找，同时也获得试验重复，每个发育关键时期均观察制片10片以上。采用改良卡宝品红并辅助使用醋酸洋红染色液染色及花粉压片法，Olympus vanox显微镜下观察并照相。
2 结果与分析
2.1不育系4-05A的雌雄蕊形态
据开花期田间观察，不育系4-05A比保持系4-05B的花长势弱(图1)，花冠偏小，花药瘦瘪，药壁呈半透明膜状，药内中空，花药不开裂，或后期干枯开裂也无花粉：而4-05B花药饱满，药室分隔明显，每个药室内可见黄色花粉，开花干燥后沿药隔缝开裂散粉。测量雌雄蕊长度(表1)可知，4-05A和4-05B都是二弱雄蕊比四强雄蕊的花药稍大，主要表现在花药长度上。4-05A比4-05B的花药长度及宽度都明显小，说明4-05A雄性不育性能不仅表现为花粉败育，而且也对整个花器官发育有负影响，尤其是雄蕊花药外形减小，四强和二弱雄蕊表现一致。但4-05A比4-05B的雌蕊却长势强，从柱头高出四强雄蕊的长度测量平均值可明显看出，4-05A柱头高度是4-05B的1.7倍，说明不育系雌蕊发育受雄性败育的影响小。不育系比保持系的雌蕊花柱较长在其他作物上也有类似情况，柱头伸出较长有利于接受外源花粉。
2.2.2雄配子体的发育 随着包裹四分体的胼胝质降解，四分孢子被释放而分开形成单个游离的小孢子花粉，每个都是独立完整的雄配子体。刚从四分 体释放出的初生小孢子体积小、细胞核大并位于中央，染色体仍清晰可数(图3，1-A、B)。随后小孢子迅速生长，体积增大，细胞外壁沉积孢粉质而增厚并具花纹及沟孑L，使染色体加深(图3，1-C、D)。因此，正常发育小孢子单核初期后用品红染色，外壁着色太深而看不到内核发育，采用洋红染色或二者对染效果较好。单核期小孢子细胞核初期位于中央(图3，2)，之后原生质液泡化，出现许多小液泡合并成1个大液泡，核被挤到一侧(图3，3)。单核经不均等有丝分裂形成二细胞小孢子(图3，4)，生殖细胞又进行1次有丝分裂(图3，5)，最终形成三细胞成熟花粉(图3，6)。成熟期花粉中营养核功能减弱不易被染色，而2个精细胞清晰可见(图3，7)。正常可育花粉粒圆形、饱满且相互分散，充满花药囊并容易散出(图3，8)。
不育系(4-05A)在四分孢子期时正常，4个小孢子能被释放分开成为单核小孢子。但单核小孢子却不能进一步发育成熟，观察异常现象主要有：(1)小孢子多数仅在单核中期就停止发育(图3，9-10)。胞质稀薄无液泡、细胞萎缩。有的小孢子能发育到单核靠边期(图3，11)，但未见有发育到二细胞期的；(2)小孢子体积小。细胞直径从初生时10 um左右(图3，9)，以后几乎不再长大(图3，11)，而正常发育的小孢子单核靠边期时细胞直径可达20-30um；(3)小孢子染色浅，用品红染色也可透过外壁看到细胞核，而正常小孢子单核中期后外壁就很厚，证明不育系小孢子外壁生长受阻，仅少数小孢子可形成三裂萌发沟的外壁(图3，11)；(4)小孢子在单核中期到靠边期时就相互粘连(图3，10)，即使通过用力敲片小孢子仍难散开，而正常情况下该时期小孢子极易从药囊中挤出并游离散开；(5)成熟期花药萎缩干瘪不散粉，有的通过挤压可看到粘在药壁上的团状物，是停滞发育后又严重粘连在一起的败育花粉粒(图3，12)，花粉中内容物已降解收缩而彻底败育。
3 讨论
3.1关于春萝卜不育系4-05A的雄性不育类型
参照周长久等对萝卜雄性不育性的划分类型，本研究通过对春萝卜不育系4-05A外部形态学观察及小孢子败育过程的细胞学研究将该不育材料归为花粉败育型，是最具有利用价值的类型。
3.2萝卜减数分裂染色体行为的特殊现象
观察春萝卜小孢子母细胞减数分裂时发现，染色体从终变期开始到四分孢子已分开，很长一段时间都处于高度凝聚的超螺旋状态，如果采用卡宝品红染色，由于染色体着色反差大，核仁又不被染色，整个细胞核区经常可见染色体能被清晰计数。尤其是在终变期，小孢子母细胞发育整齐，染色体粗短且分散，几乎能与中期I极面观相媲美(图3，6)，而且该时期明显比其他科属植物持续时间长易获得。其他时期如后期I、末期I、中期Ⅱ、末期Ⅱ、四分孢子期及小孢子幼期都可进行染色体计数，甚至整个减数分裂期间的花药药壁细胞及绒毡层细胞染色体都表现出类似现象(图2，16)。染色体这种持续非解旋现象可能与萝卜等十字花科(Cruciferae)植物减数分裂过程属胞质同时型有关，其他十字花科植物如大白菜也有类似情况，有待进一步研究探讨。
3.3关于春萝卜雄性不育系4-05A败育时期探讨
雄性不育花粉败育时期和方式多样，从小孢子造孢细胞到花粉成熟的各个发育时期都可发生，同一品系败育特征既可出现在1个时期，也可出现在相邻2个时期或多个时期。Laser在总结前人研究的基础上，提出被子植物雄性不育系花粉败育的形式和时期是多种多样的，单子叶植物花粉败育多数达到或接近双核期，双子叶植物花粉败育则多在四分小孢子时期或小孢子早期发育阶段。本研究结果表明，春萝卜不育系4-05A在四分孢子期仍正常。败育发生在小孢子早期发育阶段的单核中期到靠边期，单核小孢子出现异常，表现为停止生长，相互粘连。这一结果与董庆华等报道的萝卜雄性不育系小孢子败育其中的一种方式一花药发育受阻于单核花粉期，以及粟翼玫等报道的秋冬萝卜雄性不育系64A及其保持系64B花药和小孢子的细胞学观察结果相吻合：该结果与张丽等报道的萝卜不育小孢子的败育在造孢时期就已表现出来，以后在单核小孢子发育过程中继续表现有所差异：也与梁小红等对禾本科植物高粱不育系小孢子败育的研究结果不同。
4 结论
(1)确认了春萝卜雄性不育系4-05A具有雄性不育萝卜花器特征，雄蕊花药外形小、中空无花粉，雌蕊花柱较长。(2)观察获得春萝卜雄性不育系4—05A及其相应的保持系4-05B小孢子发生及雄配子体发育的全过程，确定花粉败育是4-05A雄性不育的根本原因，其不育类型属于花粉败育型。(3)不育系4-05A小孢子母细胞能正常进行减数分裂，形成单核花粉，减数分裂为同时型胞质分裂。(4)4—05A雄配子体进一步发育过程中，在单核中期到靠边期的发育阶段小孢子发生败育，不能形成可育的成熟花粉粒，文中概括总结出5种败育异常现象。
关键词：春萝卜；雄性不育系；4—05A；减数分裂；雄配子体；败育
萝卜(Raphanus sativus L.)是一种原产于我国的重要世界性蔬菜，其杂种优势明显。雄性不育性是作物杂种优势利用的重要手段，自1968年Ogura在日本鹿儿岛首次发现萝卜雄性不育株育成不育系，我国学者也对其不育性遗传机制进行了研究并转育应用。目前，利用雄性不育系配制生产的萝卜一代杂种已在全国各地广泛推广。春萝卜雄性不育系4-05A及其保持系4-05B是由山西省农业科学院蔬菜研究所萝卜遗传育种课题组选育的优良不育系，目前已在生产上应用配制杂交种。由于植物雄性不育花药败育时期和方式多样，为深入了解春萝卜雄性不育系4-05A的花药败育途径，本研究对该雄性不育系的花器官形态、小孢子母细胞减数分裂过程及其雄配子体发育和败育时期进行了观察和比较，以便为其雄性不育的遗传规律和性状调控研究提供理论依据，更好地利用这一育种途径。
1 材料与方法
1.1材料
春萝卜雄性不育系4-05A及其相应的保持系4-05B供试材料由山西省农业科学院蔬菜研究所萝卜育种课题组提供。
1.2方法
1.2.1 田间试验为保证萝卜雄性不育系种子纯度和质量，采用温室隔离种植及大株采种。2008年春季将前1年收获的春萝卜雄性不育系4-05A及其相应保持系4-05B的越冬种萝卜种植于山西省农业科学院蔬菜研究所日光温室，并采取隔离种植措施。花期人工授粉，将保持系花粉授给不育系从而收获种子。
1.2.2不育系及其相应保持系雌雄蕊形态解剖测量 在盛花期分别随机取20朵不育系和保持系当天开放的花，在体视显微镜下解剖观察，测量其四强及二弱雄蕊的长、宽度和柱头高出四强雄蕊的长度，然后求其平均数及标准差。
1.2.3 小孢子母细胞减数分裂过程及雄配子体发育观察根据经验。萝.花序在晴天10：00-11：00细胞分裂最旺盛，摘取未开花的完全花序固定于卡诺固定液(V无水乙醇：V冰醋酸=3：1)24 h，经95％、85％乙醇洗涤各20 min后转入70％乙醇中，于4℃冰箱保存备用。制片时从花序上挑取一定大小的单个小花苞，解剖镜下剥出花药。本品种花蕾直径1-1.5 mm时小孢子母细胞发育为减数分裂期，其他花粉发育时期可根据花蕾直径大小推测，一般同一花序并不能包括全部发育时期，需多取样寻找，同时也获得试验重复，每个发育关键时期均观察制片10片以上。采用改良卡宝品红并辅助使用醋酸洋红染色液染色及花粉压片法，Olympus vanox显微镜下观察并照相。
2 结果与分析
2.1不育系4-05A的雌雄蕊形态
据开花期田间观察，不育系4-05A比保持系4-05B的花长势弱(图1)，花冠偏小，花药瘦瘪，药壁呈半透明膜状，药内中空，花药不开裂，或后期干枯开裂也无花粉：而4-05B花药饱满，药室分隔明显，每个药室内可见黄色花粉，开花干燥后沿药隔缝开裂散粉。测量雌雄蕊长度(表1)可知，4-05A和4-05B都是二弱雄蕊比四强雄蕊的花药稍大，主要表现在花药长度上。4-05A比4-05B的花药长度及宽度都明显小，说明4-05A雄性不育性能不仅表现为花粉败育，而且也对整个花器官发育有负影响，尤其是雄蕊花药外形减小，四强和二弱雄蕊表现一致。但4-05A比4-05B的雌蕊却长势强，从柱头高出四强雄蕊的长度测量平均值可明显看出，4-05A柱头高度是4-05B的1.7倍，说明不育系雌蕊发育受雄性败育的影响小。不育系比保持系的雌蕊花柱较长在其他作物上也有类似情况，柱头伸出较长有利于接受外源花粉。
2.2.2雄配子体的发育 随着包裹四分体的胼胝质降解，四分孢子被释放而分开形成单个游离的小孢子花粉，每个都是独立完整的雄配子体。刚从四分 体释放出的初生小孢子体积小、细胞核大并位于中央，染色体仍清晰可数(图3，1-A、B)。随后小孢子迅速生长，体积增大，细胞外壁沉积孢粉质而增厚并具花纹及沟孑L，使染色体加深(图3，1-C、D)。因此，正常发育小孢子单核初期后用品红染色，外壁着色太深而看不到内核发育，采用洋红染色或二者对染效果较好。单核期小孢子细胞核初期位于中央(图3，2)，之后原生质液泡化，出现许多小液泡合并成1个大液泡，核被挤到一侧(图3，3)。单核经不均等有丝分裂形成二细胞小孢子(图3，4)，生殖细胞又进行1次有丝分裂(图3，5)，最终形成三细胞成熟花粉(图3，6)。成熟期花粉中营养核功能减弱不易被染色，而2个精细胞清晰可见(图3，7)。正常可育花粉粒圆形、饱满且相互分散，充满花药囊并容易散出(图3，8)。
不育系(4-05A)在四分孢子期时正常，4个小孢子能被释放分开成为单核小孢子。但单核小孢子却不能进一步发育成熟，观察异常现象主要有：(1)小孢子多数仅在单核中期就停止发育(图3，9-10)。胞质稀薄无液泡、细胞萎缩。有的小孢子能发育到单核靠边期(图3，11)，但未见有发育到二细胞期的；(2)小孢子体积小。细胞直径从初生时10 um左右(图3，9)，以后几乎不再长大(图3，11)，而正常发育的小孢子单核靠边期时细胞直径可达20-30um；(3)小孢子染色浅，用品红染色也可透过外壁看到细胞核，而正常小孢子单核中期后外壁就很厚，证明不育系小孢子外壁生长受阻，仅少数小孢子可形成三裂萌发沟的外壁(图3，11)；(4)小孢子在单核中期到靠边期时就相互粘连(图3，10)，即使通过用力敲片小孢子仍难散开，而正常情况下该时期小孢子极易从药囊中挤出并游离散开；(5)成熟期花药萎缩干瘪不散粉，有的通过挤压可看到粘在药壁上的团状物，是停滞发育后又严重粘连在一起的败育花粉粒(图3，12)，花粉中内容物已降解收缩而彻底败育。
3 讨论
3.1关于春萝卜不育系4-05A的雄性不育类型
参照周长久等对萝卜雄性不育性的划分类型，本研究通过对春萝卜不育系4-05A外部形态学观察及小孢子败育过程的细胞学研究将该不育材料归为花粉败育型，是最具有利用价值的类型。
3.2萝卜减数分裂染色体行为的特殊现象
观察春萝卜小孢子母细胞减数分裂时发现，染色体从终变期开始到四分孢子已分开，很长一段时间都处于高度凝聚的超螺旋状态，如果采用卡宝品红染色，由于染色体着色反差大，核仁又不被染色，整个细胞核区经常可见染色体能被清晰计数。尤其是在终变期，小孢子母细胞发育整齐，染色体粗短且分散，几乎能与中期I极面观相媲美(图3，6)，而且该时期明显比其他科属植物持续时间长易获得。其他时期如后期I、末期I、中期Ⅱ、末期Ⅱ、四分孢子期及小孢子幼期都可进行染色体计数，甚至整个减数分裂期间的花药药壁细胞及绒毡层细胞染色体都表现出类似现象(图2，16)。染色体这种持续非解旋现象可能与萝卜等十字花科(Cruciferae)植物减数分裂过程属胞质同时型有关，其他十字花科植物如大白菜也有类似情况，有待进一步研究探讨。
3.3关于春萝卜雄性不育系4-05A败育时期探讨
雄性不育花粉败育时期和方式多样，从小孢子造孢细胞到花粉成熟的各个发育时期都可发生，同一品系败育特征既可出现在1个时期，也可出现在相邻2个时期或多个时期。Laser在总结前人研究的基础上，提出被子植物雄性不育系花粉败育的形式和时期是多种多样的，单子叶植物花粉败育多数达到或接近双核期，双子叶植物花粉败育则多在四分小孢子时期或小孢子早期发育阶段。本研究结果表明，春萝卜不育系4-05A在四分孢子期仍正常。败育发生在小孢子早期发育阶段的单核中期到靠边期，单核小孢子出现异常，表现为停止生长，相互粘连。这一结果与董庆华等报道的萝卜雄性不育系小孢子败育其中的一种方式一花药发育受阻于单核花粉期，以及粟翼玫等报道的秋冬萝卜雄性不育系64A及其保持系64B花药和小孢子的细胞学观察结果相吻合：该结果与张丽等报道的萝卜不育小孢子的败育在造孢时期就已表现出来，以后在单核小孢子发育过程中继续表现有所差异：也与梁小红等对禾本科植物高粱不育系小孢子败育的研究结果不同。
4 结论
(1)确认了春萝卜雄性不育系4-05A具有雄性不育萝卜花器特征，雄蕊花药外形小、中空无花粉，雌蕊花柱较长。(2)观察获得春萝卜雄性不育系4—05A及其相应的保持系4-05B小孢子发生及雄配子体发育的全过程，确定花粉败育是4-05A雄性不育的根本原因，其不育类型属于花粉败育型。(3)不育系4-05A小孢子母细胞能正常进行减数分裂，形成单核花粉，减数分裂为同时型胞质分裂。(4)4—05A雄配子体进一步发育过程中，在单核中期到靠边期的发育阶段小孢子发生败育，不能形成可育的成熟花粉粒，文中概括总结出5种败育异常现象。