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【摘要】 目的 体外人血灌注猪肾,初步探讨异种肾移植超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)机理。方法 将猪肾随机分为对照组(1组,3例)采用猪自体血灌注,试验组分别采用人全血(2组,5例)、补体去活化人血(3组,5例)和去除天然抗体人血(4组,5例),灌注离体猪肾30 min,计算每5 min肾血流率和肾血管阻力,灌注结束后肾组织样本行免疫组化病理检查。结果 2组猪肾出现HAR,血管阻力增加,血流率下降,无泌尿。余三组猪肾未出现HAR,血管阻力及血流量维持稳定,持续有泌尿。结论 人血补体去活化或天然抗体廓清可避免灌注猪肾时的HAR。
【关键词】 异种移植;排斥反应;肾脏
Research of xenograft hyperacute rejection by perfusing pig kidneys with human blood in vitro
XIONG Da-fu,JIA Ying-bin,GUAN Xiao-dong,et al. Department of General Surgery Ⅲ,the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Zhuhai 519000, China
【Abstract】 Objective Ex vivo studies by perfusing pig kidneys with differents blood to evaluate human antiporcine xenograft hyperacute rejection.Methods Pig kidneys were perfused for 30 minutes with pig blood (group 1; n=3),human blood (group 2; n=5),complement heat innactivated human blood (group 3; n=5),and xenoreactive natural antibodies (XNA)-depleted human blood (group 4; n=5).Renal blood flow rate and vascular resistance were caculated very 5 minutes.Histologic and immunohistologic examinations were carried out after perfusion.Results Pig kidneys perfused with human blood,group 2,showed HAR,higher vascular resistance and lower blood flow rate.Kidneys in Group 1,3,4 had no histologic evidence of HAR.Blood flow rate and vasular resistance kept steady.Conclusion The depletion of complement or XNA in human blood protected pig kidneys form HAR.
【Key words】 Xenotransplant; Rejection; Kidney
逐年增多的等待肾移植患者使得肾脏的供需矛盾日益紧张,异种移植是缓解肾源短缺状况的可能途径之一。然而大量研究发现,人体内预存的反应性天然抗体(xenogenic natural antibody,XNA)可识别广泛存在于非灵长类动物血管内皮的a-1,3半乳糖(alpha 1,3-Galactose,a-Gal)抗原发生超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR),导致移植肾在数分钟之内丧失功能。克服HAR,首要的是了解其机制,本研究采用不同成分人血离体灌注猪肾,制造异种肾移植动物模型,初步探讨HAR病变机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 试验用猪共10只,购自中山大学北校区实验动物中心。取肾方法见笔者先前研究[1]。简单的说,气管插管全麻后,腹部“十”切口,腹主动脉插管,原位灌注HCA液,整块切取,在0℃～4℃生理盐水中修整。共20个肾脏,因不便于灌注,去除两个多支动脉肾脏。试验用猪肾共18个,质量(108±7)g,热缺血时间为0,冷缺血时间(32±5)min,随机分为四组,分别采用猪自体血(1组,n=3)、人全血(2组,n=5)、补体去活化人血(3组,n=5)、去天然抗体人血(4组,n=5)离体灌注,所有人血均为O型。
1.2 人血补体去活化 将人血放入56℃水浴中加热30 min,加热过程中须规则摇晃均匀,使血中补体成分去活化。
1.3 人血天然抗体免疫吸附 采用上海沪尚生物科技有限公司免疫吸附柱,配体采用多克隆抗人免疫球蛋白抗体(Ig-Therasorb吸附),通过抗原-抗体反应去除血浆中的天然抗体。
1.4 离体灌注模型 肾动脉套接输血器并用丝线固定,血袋经输血加压器加压,灌注压维持80~90 mm Hg;肾静脉连接采血袋,回收血液并用于再循环;输尿管连接无菌袋收集尿液。灌注时间30 min,灌注血初始温度37℃。
1.5 肾血流率和血管阻力 从灌注开始,每5 min计量各组灌注血量,计算肾血流率=血流量/时间,肾血管阻力=灌注压/血流率。
1.6 统计学方法 所有数据以均值±标准差(x±s)表示,采用Stata10.0软件和单因素方差分析方法(one-way Anova)分析组间数据,进而以t检验分析两组间数据,以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察 第1、3、4组肾脏充盈良好,色红润,肾体搏动良好,有泌尿,输尿管充盈。第2组在开始灌注后数分钟,肾脏呈暗紫色,表面出现花斑,质地变软,肾体无明显搏动,整个灌注过程无泌尿。
2.2 免疫病理 1组仅见少许肾小管损伤。3组可见肾小管损伤,间质轻度水肿,血管内膜有IgM、IgG沉积。4组可见肾小管损伤,间质轻度水肿,血管内膜有补体C3、C1q沉积。2组可见广泛血管壁坏死,微血栓形成,间质出血、水肿显著,血管内膜有IgM、IgG、C3、C1q沉积。
2.3 肾脏功能状态 1、3、4组每5 min时间段的平均肾脏灌注血流率62~82 ml/min,各组间无统计学差异(P>0.05);2组的平均肾脏灌注血流率在初始5 min阶段已较上三组降低,且在随后两个5 min时间段内迅速下降并稳定于18 ml/min左右,其在各时间段内与上述三组均有明显差异(P<0.05),见图1。同样,1、3、4组肾血管阻力维持较低水平,组间无统计学差异(P>0.05),2组肾血管阻力在起始两个5 min时间段内迅速升高,此后稳定在高阻力状态,与上述三组间存在统计学差异(P<0.05),见图2。
图1 不同成分血液离体灌注猪肾的血
图2 不同成分血离体灌注猪肾的肾血管阻力
3 讨论
异种肾移植作为可能缓解临床肾源短缺的途径之一已得到了多方面的研究。由于猪肾的大小、重量,解剖结构和生理指标均与人肾类似,而且猪易饲养、繁殖,携带的病原体易控制,于人类无心理和伦理障碍,因此猪肾成为研究的最佳选择。HAR是异种肾移植面临的首要障碍,a-Gal抗原广泛存在于非灵长类动物细胞表面,不存在于人类细胞,是引起HAR的主要异种抗原。
本研究表明,用人血离体灌注猪肾的异种肾移植模型中,人全血灌注猪肾数分钟后,即出现HAR,移植肾失活,免疫病理显示血管内皮广泛沉积人天然抗体IgM、IgG和补体C3、C1q,广泛微血管血栓和间质出血,说明人体内预存的抗a-Gal抗体,补体及凝血系统均参与了HAR过程。Shimizu A等[2,3]的研究认为,HAR是预存的XNA识别a-Gal抗原,从而激活补体,进一步激活血管内皮细胞,介导血管内皮损伤及广泛微血栓形成。2组中肾血流率降低及肾血管阻力升高,正是广泛微循环栓塞的结果。
3、4组肾血管内皮虽然也有抗a-Gal的IgM、IgG或补体C3、C1q沉积,肾脏却未表现出HAR反应,说明抗体和补体在HAR发生过程中起协同作用,缺乏预存抗体或缺乏补体激活均可避免异种移植的HAR反应。在其他异种器官移植中也有类似现象,Ramírez等[4]通过转基因方法,使猪肝脏血管内皮细胞表达狒狒细胞膜上的补体调节蛋白(如CD55,CD59),将此转基因肝脏移植的狒狒体内,受体的免疫系统不再将异种肝脏视为“非己”,成功抑制了HAR发生,在异种肝移植中证实补体活化在HAR机制中的作用。同样,在Pfeiffer S等[5]的研究中,一组对象是用人全血离体灌注表达人补体调节蛋白的转基因猪肺,另一组采用封闭天然抗体的人血灌注野生型猪肺,均成功避免了HAR,而且病理结果显示,封闭天然抗体在抑制HAR方面的效果更好。
本研究的终点选择在离体灌注30 min后,对于HAR这一研究目标是比较充分的,但对于后续的异种急性排斥反应等可能事件无法涉及,因此,尽管本研究的3,4组有效避免了HAR,异种肾在短时间内维持了泌尿功能,但对应用前景尚不能乐观。实际上,异种移植是一个复杂的课题,面临诸多免疫学问题,而且,异种器官的生理功能、种间传染病等问题也尚待研究。
参考文献
[1] 贾英斌,于立新,徐健,等.猪胰肾联合移植动脉模型的建立.新乡医学院学报,2002,19(3):161-162.
[2] Shimizu A,Yamada K. Pathology of renal xenograft rejection in pig to non-human primate transplantation. Clin Transplant,2006,20(15):46-52.
[3] Shimizu A,Yamada K,Yamamoto S,et al. Thrombotic microangiopathic glomerolopathy in human decay accelerating factor-transgenic swine-to-baboon kidney xenografts. J Am Soc Nephrol,2005,16(9):2732-2745.
[4] Ramírez P,Montoya MJ,Ríos A et al. Prevention of hyperacute rejection in a model of orthotopic liver xenotransplantation from pig to baboon using polytransgenic pig livers (CD55,CD59,and H-transferase). Transplant Proc,2005,37(9):4103-4106.
[5] Pfeiffer S,Zorn GL 3rd,Blair KS et al. Hyperacute lung rejection in the pig-to-human model 4: evidence for complement and antibody independent mechanisms. Transplantation,2005,27,79(6):662-671.
【关键词】 异种移植;排斥反应;肾脏
Research of xenograft hyperacute rejection by perfusing pig kidneys with human blood in vitro
XIONG Da-fu,JIA Ying-bin,GUAN Xiao-dong,et al. Department of General Surgery Ⅲ,the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University,Zhuhai 519000, China
【Abstract】 Objective Ex vivo studies by perfusing pig kidneys with differents blood to evaluate human antiporcine xenograft hyperacute rejection.Methods Pig kidneys were perfused for 30 minutes with pig blood (group 1; n=3),human blood (group 2; n=5),complement heat innactivated human blood (group 3; n=5),and xenoreactive natural antibodies (XNA)-depleted human blood (group 4; n=5).Renal blood flow rate and vascular resistance were caculated very 5 minutes.Histologic and immunohistologic examinations were carried out after perfusion.Results Pig kidneys perfused with human blood,group 2,showed HAR,higher vascular resistance and lower blood flow rate.Kidneys in Group 1,3,4 had no histologic evidence of HAR.Blood flow rate and vasular resistance kept steady.Conclusion The depletion of complement or XNA in human blood protected pig kidneys form HAR.
【Key words】 Xenotransplant; Rejection; Kidney
逐年增多的等待肾移植患者使得肾脏的供需矛盾日益紧张,异种移植是缓解肾源短缺状况的可能途径之一。然而大量研究发现,人体内预存的反应性天然抗体(xenogenic natural antibody,XNA)可识别广泛存在于非灵长类动物血管内皮的a-1,3半乳糖(alpha 1,3-Galactose,a-Gal)抗原发生超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR),导致移植肾在数分钟之内丧失功能。克服HAR,首要的是了解其机制,本研究采用不同成分人血离体灌注猪肾,制造异种肾移植动物模型,初步探讨HAR病变机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 试验用猪共10只,购自中山大学北校区实验动物中心。取肾方法见笔者先前研究[1]。简单的说,气管插管全麻后,腹部“十”切口,腹主动脉插管,原位灌注HCA液,整块切取,在0℃～4℃生理盐水中修整。共20个肾脏,因不便于灌注,去除两个多支动脉肾脏。试验用猪肾共18个,质量(108±7)g,热缺血时间为0,冷缺血时间(32±5)min,随机分为四组,分别采用猪自体血(1组,n=3)、人全血(2组,n=5)、补体去活化人血(3组,n=5)、去天然抗体人血(4组,n=5)离体灌注,所有人血均为O型。
1.2 人血补体去活化 将人血放入56℃水浴中加热30 min,加热过程中须规则摇晃均匀,使血中补体成分去活化。
1.3 人血天然抗体免疫吸附 采用上海沪尚生物科技有限公司免疫吸附柱,配体采用多克隆抗人免疫球蛋白抗体(Ig-Therasorb吸附),通过抗原-抗体反应去除血浆中的天然抗体。
1.4 离体灌注模型 肾动脉套接输血器并用丝线固定,血袋经输血加压器加压,灌注压维持80~90 mm Hg;肾静脉连接采血袋,回收血液并用于再循环;输尿管连接无菌袋收集尿液。灌注时间30 min,灌注血初始温度37℃。
1.5 肾血流率和血管阻力 从灌注开始,每5 min计量各组灌注血量,计算肾血流率=血流量/时间,肾血管阻力=灌注压/血流率。
1.6 统计学方法 所有数据以均值±标准差(x±s)表示,采用Stata10.0软件和单因素方差分析方法(one-way Anova)分析组间数据,进而以t检验分析两组间数据,以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察 第1、3、4组肾脏充盈良好,色红润,肾体搏动良好,有泌尿,输尿管充盈。第2组在开始灌注后数分钟,肾脏呈暗紫色,表面出现花斑,质地变软,肾体无明显搏动,整个灌注过程无泌尿。
2.2 免疫病理 1组仅见少许肾小管损伤。3组可见肾小管损伤,间质轻度水肿,血管内膜有IgM、IgG沉积。4组可见肾小管损伤,间质轻度水肿,血管内膜有补体C3、C1q沉积。2组可见广泛血管壁坏死,微血栓形成,间质出血、水肿显著,血管内膜有IgM、IgG、C3、C1q沉积。
2.3 肾脏功能状态 1、3、4组每5 min时间段的平均肾脏灌注血流率62~82 ml/min,各组间无统计学差异(P>0.05);2组的平均肾脏灌注血流率在初始5 min阶段已较上三组降低,且在随后两个5 min时间段内迅速下降并稳定于18 ml/min左右,其在各时间段内与上述三组均有明显差异(P<0.05),见图1。同样,1、3、4组肾血管阻力维持较低水平,组间无统计学差异(P>0.05),2组肾血管阻力在起始两个5 min时间段内迅速升高,此后稳定在高阻力状态,与上述三组间存在统计学差异(P<0.05),见图2。
图1 不同成分血液离体灌注猪肾的血
图2 不同成分血离体灌注猪肾的肾血管阻力
3 讨论
异种肾移植作为可能缓解临床肾源短缺的途径之一已得到了多方面的研究。由于猪肾的大小、重量,解剖结构和生理指标均与人肾类似,而且猪易饲养、繁殖,携带的病原体易控制,于人类无心理和伦理障碍,因此猪肾成为研究的最佳选择。HAR是异种肾移植面临的首要障碍,a-Gal抗原广泛存在于非灵长类动物细胞表面,不存在于人类细胞,是引起HAR的主要异种抗原。
本研究表明,用人血离体灌注猪肾的异种肾移植模型中,人全血灌注猪肾数分钟后,即出现HAR,移植肾失活,免疫病理显示血管内皮广泛沉积人天然抗体IgM、IgG和补体C3、C1q,广泛微血管血栓和间质出血,说明人体内预存的抗a-Gal抗体,补体及凝血系统均参与了HAR过程。Shimizu A等[2,3]的研究认为,HAR是预存的XNA识别a-Gal抗原,从而激活补体,进一步激活血管内皮细胞,介导血管内皮损伤及广泛微血栓形成。2组中肾血流率降低及肾血管阻力升高,正是广泛微循环栓塞的结果。
3、4组肾血管内皮虽然也有抗a-Gal的IgM、IgG或补体C3、C1q沉积,肾脏却未表现出HAR反应,说明抗体和补体在HAR发生过程中起协同作用,缺乏预存抗体或缺乏补体激活均可避免异种移植的HAR反应。在其他异种器官移植中也有类似现象,Ramírez等[4]通过转基因方法,使猪肝脏血管内皮细胞表达狒狒细胞膜上的补体调节蛋白(如CD55,CD59),将此转基因肝脏移植的狒狒体内,受体的免疫系统不再将异种肝脏视为“非己”,成功抑制了HAR发生,在异种肝移植中证实补体活化在HAR机制中的作用。同样,在Pfeiffer S等[5]的研究中,一组对象是用人全血离体灌注表达人补体调节蛋白的转基因猪肺,另一组采用封闭天然抗体的人血灌注野生型猪肺,均成功避免了HAR,而且病理结果显示,封闭天然抗体在抑制HAR方面的效果更好。
本研究的终点选择在离体灌注30 min后,对于HAR这一研究目标是比较充分的,但对于后续的异种急性排斥反应等可能事件无法涉及,因此,尽管本研究的3,4组有效避免了HAR,异种肾在短时间内维持了泌尿功能,但对应用前景尚不能乐观。实际上,异种移植是一个复杂的课题,面临诸多免疫学问题,而且,异种器官的生理功能、种间传染病等问题也尚待研究。
参考文献
[1] 贾英斌,于立新,徐健,等.猪胰肾联合移植动脉模型的建立.新乡医学院学报,2002,19(3):161-162.
[2] Shimizu A,Yamada K. Pathology of renal xenograft rejection in pig to non-human primate transplantation. Clin Transplant,2006,20(15):46-52.
[3] Shimizu A,Yamada K,Yamamoto S,et al. Thrombotic microangiopathic glomerolopathy in human decay accelerating factor-transgenic swine-to-baboon kidney xenografts. J Am Soc Nephrol,2005,16(9):2732-2745.
[4] Ramírez P,Montoya MJ,Ríos A et al. Prevention of hyperacute rejection in a model of orthotopic liver xenotransplantation from pig to baboon using polytransgenic pig livers (CD55,CD59,and H-transferase). Transplant Proc,2005,37(9):4103-4106.
[5] Pfeiffer S,Zorn GL 3rd,Blair KS et al. Hyperacute lung rejection in the pig-to-human model 4: evidence for complement and antibody independent mechanisms. Transplantation,2005,27,79(6):662-671.