【摘 要】
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目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂
【机 构】
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中国医科大学实验动物部,沈阳,110001中国医科大学实验动物部,沈阳,110001;中国医科大学病理学与病理生理学研究室,沈阳,110001
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目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinⅤ-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染D J-1基因的NIH3T3阳性细胞细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别；细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达质载体,成功筛选出稳定表达D J-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.
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